丙型肝炎合成肽疫苗的研究進展與展望

　　《國外醫學》預防、診斷、治療用生物制品分冊1999年第22卷第1期

　　第三軍醫大學西南醫院全軍傳染病專科中心（400038）

　　宋志強綜述郝飛審校

　　摘要合成肽疫苗具有常規疫苗不可比擬的優點，近年來得到廣泛研究。本文介紹了預防性和治療性丙型肝炎病毒（ hVC）合成肽疫苗的研制及效果。

　　關鍵詞：丙型肝炎合成肽疫苗多抗原肽包膜蛋白高變區表位

　　近年來有關 hCV感染的研究進展很快，但主要體現在實驗診斷技術的發展、抗病毒治療的應用、發病機理的探討和病理改變的觀察等方面，而有關 hCV感染的保護性免疫和疫苗制備的研究進展則很慢。雖然 hCV檢測技術的改進和提高已大大降低血液制品傳播 hCV的危險性，但在高危人群中 hCV感染仍嚴重，甚至不少感染者並沒有明顯的輸血史；由于 hCV基因序列的高度變異性，導致 hCV準種(quasispecies)的存在和免疫逃避現象，從而使 hCV得以逃脫宿主免疫機制作用，造成 hCV感染慢性化，因此，研究預防/治療性疫苗，以控制 hCV感染有著重要意義。合成肽疫苗由于具有制備容易、可大量生產以及穩定、易保存、副作用少和使用較安全等優點，近幾年得到了廣泛重視。本文擬將 hCV合成肽疫苗的發展作一綜述。

　　預防性疫苗

　　hCV在生物學分類上與動物的瘟病毒和人類的黃病毒相似。已知黃病毒非結構（ nS）蛋白和瘟病毒 gp33/gp55可刺激機體產生中和抗體，提示與其基因和疏水圖非常相似的 hCV包膜蛋白可能是機體免疫攻擊的靶。 choo等^[1]曾用重組痘苗病毒在 heLa細胞中表達的 hCV包膜蛋白 e1和 e2接種7只黑黑猩猩，證實 hCV e蛋白誘生的抗體是中和性抗體，可以預防/阻止病毒持續感染，故能夠作為預防性疫苗。 farci等^[2]將一慢性 hCV感染者不同年代的血漿滅活，並與病毒混合後接種黑猩猩，以研究 hCV感染者體內是否有特異性中和抗體。結果發現，用該患者感染 hCV14年的血漿與病毒混和物接種的黑猩猩全部被感染，而用該患者感染 hCV2年的血漿與病毒混和物接種，黑猩猩未發生 hCV感染，因此作者認為在慢性 hCV感染者體內有 hCV準種和特異性中和抗體。隨後該作者^[3]以 hCVH77高變區1（ hVR1）合成的兩條肽390～410和384～414氨基酸免疫家兔後得到抗 hVR1超免疫血清，然後給5只黑猩猩接種這種血清與不同 hCV準種 h77/H79混合物，結果顯示抗-HVR1對同源 h77株有免疫防禦作用，對混合的 hCV準種則無此作用，因此認為：中和抗體攻擊的主要靶位是 e2/NS1的 hVR1，而且抗-HVR1的中和作用有病毒株特異性。

　　weiner^[4]F發現 e2存在兩個 hVR，並確定 hVR含有誘生中和抗體的表位。 rosa等^[5]結合細胞熒光標記與流式細胞計數技術，建立了 hCVE2蛋白與靶細胞結合中和定量檢測系統，結果提示至少存在兩個中和性表位，一個是高度變異的，另一個存在于 e2的其他區域。 zibert等^[6]以成纖維細胞（ vH3）研究體外阻斷 hCV感染也發現抗-HVR1的中和作用有少部分存在交叉反應，不是所有抗-HVR都是株特異的；他們還觀察到 hCV感染的早期即出現抗包膜糖蛋白上 hVR1的抗體可導致自限性感染，說明抗-HVR1具有保護作用，可以阻斷 hCV感染的發展^[7]。所有這些都提示中和抗體的攻擊靶位是 e2/NS1的 hVR1，以 hCV包膜糖蛋白 hVR1為基礎備預防性疫苗是可行的。

　　但是中和抗體識別的蛋白表位大多是不連續的，即中和性抗原表位大多是構象的，抗體識別的是構型而非組成它們的序列，這在對口蹄病毒（ fMDV）中具有誘生中和抗體的肽段的 x射線晶體分子衍射分析及其他一些試驗得到證實^[8]；最近的研究也表明 e1E2復合體上構型表位的形成對包膜糖蛋白誘導機體產生保護性免疫方面起著重要作用^[9]。這就要求在合成 hCV包膜糖蛋白的多肽疫苗時不但注意所選擇肽段的免疫原性，而且必須考慮免疫原性蛋白和其他蛋白質及核酸三者間的交互作用所涉及到的構象限制。因此，研究並模擬 e蛋白表位的構型和在細胞膜上的暴露狀態，是最終制備有效疫苗的基礎。

　　多抗原肽（ mAP）是以核心基質為交聯體或樹狀臂，將若幹條抗原表位相同或不同的單體肽偶聯在一起，形成樹枝結構，則不但可克服上述方法的不足，而且能很好模擬天然表位構象，具有明顯的優越性，已經用于人類免疫缺陷症病毒（ hIV）、 fMDV、乙型肝炎病毒（ hBV）和瘧原蟲等多種病原體保護性抗原的分析和分子疫苗的設計。 mAP骨架僅含多個賴氨酸，能在確切的部位結合4條或8條多肽鏈，多肽鏈的分子量可佔整個疫苗的95%；由于 mAP上肽鏈結合的數量及位置確切，制備的疫苗結構均一、純度高， mAP與多肽的結構物免疫原性強，無需再偶聯載體蛋白便能誘生高滴度、高親和力的抗體，而 mAP本身沒有免疫原性，故既能提高疫苗的質量又能去除載體蛋白的缺陷。

　　治療性疫苗

　　由于目前也有學者認為 hCV感染後不能產生有效的保護性抗體，故細胞免疫在抗 hCV感染中的作用越來越受到重視。細胞毒性 t細胞（ cTL）是執行細胞免疫應答的主要效應細胞，屬于 cD8⁺T細胞，當其表面受體（ tCR）與靶細胞的 hCV抗原結合後，在主要組織相容性復合物（ mHC）Ⅰ類抗原的介導下，通過溶解受感染的靶細胞達到清除病毒的目的，但同時亦可造成感染組織的損傷。研究表明，丙型肝炎患者的肝髒病理變化主要表現為匯管區淋巴細胞聚集和淋巴濾泡形成，在肝髒碎屑樣壞死區以 cD4⁺細胞浸潤為主，而在肝小葉區則以 cD8⁺細胞居多；急慢性 hCV感染者外週血和肝髒中特異性 cTL可以識別 hCV編碼蛋白質中的一個或多個表位；人工合成的 hCV多肽，可在體外刺激 cTL增殖，並增強其溶解 hCV感染靶細胞的能力，因此 cTL在清除 hCV感染中可能起重要作用。

　　kita等^[10]發現用 hCV核心區合成多肽反復刺激病人的外週血單個核細胞（ pBMC）後，能誘導 cD8⁺的特異性抗 hCV cTL，這種 cTL不但識別與 hLA-B44⁺分子相結合的核殼蛋白（ nP）81-100合成多肽，而且還能溶解 vAC-HCV感染的靶細胞。該作者^[11]又用重組 hCVNP和合成的重疊肽作抗原對3例慢性丙型肝炎病人的 pBMC反復刺激，發現他們均可產生能識別 nP81-100序列的特異性、 hLA-B44⁺限制中 cTL；在1例病人中觀察到能識別 nP1-120序列的外週血淋巴細胞，並證明其屬 cD4⁺T細胞，主要識別 nP21-40表位和81-100表位，而 nP1-120和 th表位可在體外增強 hCV特異性 cTL產生。作者注意到此病人血液 hCV陰性，丙氨酸轉氨酶（ aLT）水平也正常，而另兩例存在 nP卻無 cTL活性增強的病人，血液 hCV陽性， aLT水平升高。作者認為當持續感染 hCV時，盡管 cTL參與免疫病理損傷導致嚴重肝損傷，但可加速感染機體中 hCV的清除； th表位的存在不但可增強 hCVNP特異性 cTL反應性，而且可通過與 b表位的內在作用提高抗體水平，從而增加機體抵抗 hCV感染的免疫力。

　　lechmann等^[12]對 hCV感染後不同轉歸的病人進行了體液和細胞免疫研究，共觀察了10例抗 hCVA血清陽性的無症狀獻血者（ a組）和29例慢性丙型肝炎病人（ b組）血清中的抗體水平及對 hCV刺激後的淋巴細胞增殖應答，也發現了類似現象：（1） a組病例可出現較強的 t細胞增殖應答，但血中肽特異性抗體水平很低甚至檢測不出；而 b組 b細胞應答較普遍；（2）通過在每組用同一肽刺激引起的增殖應答，可確定核心區至少存在5個不同的 cTL表位（20～44、39～63、79～103、118～152和148～172位氨基酸），而 e區有3個 cTL表位（198～252、308～372、368～392位氨基酸）。作者認為在血清抗-HCV陽性的無症狀病人中抗體滴度低的原因可能與這些病人的強 t細胞效應抑制了病毒復制從而導致病毒抗原刺激的減弱或消失。

　　需要注意的是，盡管在感染者體內有特異性 cTL，但大部分 hCV感染者仍轉為慢性。推測其原因可能有：（1）免疫選擇壓力造成了 cTL表位發生突變，導致特異性 cTL功能喪失；（2）機體大量淋巴細胞被 hCV感染，使機體免疫受損；（3）體內 hCV滴度太低，引起機體產生的 cTL應答太弱。目前傾向于認為 hCV基因高度變異發生免疫逃避，從而使感染持續存在。因此，探討 cTL疫苗的交叉保護性無疑有著重要作用。

　　shirai等^[13]發現含 hIVgp160多重表位的 th表位的合成肽與對 mHC選擇性低的通用 th表位(promiscuous t epitopes)相似。為研究內源和外源 th表位對 cTL效應的影響，作者將合成的 nS5區的 cTL表位肽（ p17） n端與上述 hIV的通用 th表位偶聯成一嵌合肽（ pCLUS3-17），並比較了其與全長核心區 cTL表位肽（ c7）、核心區含 cTL表位的部分區段（ c7A10）在 bALB/c小鼠體內誘生抗 hCV cTL的差異。結果顯示 p17肽單獨免疫小鼠所誘生的 cTL增殖效應明顯比 pCLUS3-17弱，提示 p17肽中缺乏 th表位，而含 th表位的 c17能誘生很強的 cTL效應；同樣，可能缺乏 th表位的 c7A10肽誘生的 cTL效應亦較弱。作者由此確信，無免疫原性的肽可通過嵌入合適的多 th細胞表位而改造成有免疫原性的肽；對缺乏內源性 th表位誘導活性的 cTL表位肽；應共價結合廣譜 th表位；對已包含內源性 th表位的 cTL表位肽，加入上述廣譜 th表位可擴充 mHC識別類型，這樣可使疫苗的保護作用更有效。這無疑對構建免疫原性強，具有交叉保護作用的 cTL合成肽疫苗提供了很好的思路。

　　已經明確，病毒抗原中同時存在增強性和抑制性表位。為提高免疫保護作用，應努力提高增強性表位的作用，降低和摒除抑制性表位作用。就 hCV感染而言，研究 cTL增強性表位的報道較多，尚未見抑制性表位或增強性表位抗體對 cTL功能影響的研究，也就是注重了病毒抗原表位對 cTL功能的正性作用，而忽略了病毒抗原表位及其抗體對 cTL功能的負性影響，這樣對闡述 hCV感染時 cTL功能缺陷存在片面性。因此，研究抗 hCVA抑制性表位或增強性表位抗體對 cTL功能的抑制作用，無疑可以從深層次上揭示 hCV感染對 cTL功能缺陷的原因，對 hCV感染時免疫耐受的形成和指導疫苗的研究均有重要意義。另外， mAP在 hIV、 fMDV、 hBV等保護性抗原分析和分子疫苗中的成功應用，對設計和制備 hCV疫苗是一個有益的啟示。由 th表位、中和性表位和/或 cTL表位組成的並且有一定構象的大分子嵌合肽可能最終成為有效的疫苗。

　　參考文獻

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