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腦損傷中的TGF β、TNF-α和β aPP細胞信號作用
第三軍醫大學學報1999年第21卷第6期
黎海濤* 董燕麟 羅向東
關鍵詞：澱粉前體蛋白 轉化生長因子 腫瘤壞死因子 細胞因子 腦損傷
在急慢性腦損傷中β澱粉前體蛋白(β amyloid precursor protein, β APP)、轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF β1)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是較突出的炎性細胞因子。這些腦損傷相關因子(Injury-associated factors)通過它們的變化作用(如表達水平，功能和代謝的變化，以及可能影響細胞易感性的基因和環境因素等)對中樞神經系統(CNS)產生影響。
1 TGB β、TNF-α和β aPP：腦損傷的應答介質
TGF β，TNF-α和β APP都有著各自的家族成員。β aPP的家族成員包括一系列進化中保存的澱粉前體類蛋白。TGFβ家族的五個成員已確定，它們與哺乳動物的抑制蛋白，激活蛋白和Mullerian抑制物質有關。膠質細胞系衍生的神經營養因子(GDNF)也與TGFβ家族有關﹝1﹞。TNF-α的同族包括淋巴細胞毒素-α(TGFβ)，CD40，CD30和CD27的配子體﹝2﹞。
激活的TGF β是一類二硫鍵連接的同源二聚體蛋白(Disultide-linked homodimeric protein)，由兩個同等的氨基酸亞單位組成。TGF β單體通過復合蛋白水解酶鏈由未激活的390氨基酸殘基前體蛋白產生﹝3﹞。幾乎所有哺乳類動物的成熟腦組織中星形膠質細胞，小神經膠質細胞和少突神經膠質細胞都能正常的表達TGFβ，但神經細胞中的TGF β mRNA水平極低﹝4﹞。哺乳類動物腦內3個同源異構體TGFβ已確定，而目前對TGF β1研究得最為廣泛。TNF-α是一17×103u多體肽，它在附著TNF受體時被激活。TNF-α多由星形膠質細胞和小神經膠質細胞表達﹝5﹞。β aPP是一種可能含有Kunitz型蛋白酶抑制物(Kunitz-type protease inhibitor,KPI)區的110～126×103u跨膜糖蛋白。從細胞表面釋放兩種分泌型的β aPP蛋白水解裂切(Proteolytic cleavages)：一種是發生于澱粉樣蛋白β肽(Amyloidβ-peptide,A β)序列中段(位于第16～17個氨基酸之間)的α-分泌酶(α-secretase)，其導致sAPPα的釋放並阻止完整A β的釋放。另一分泌酶(β-secretase)在A β n-末端切開β APP從而導致sAPP β和完整A β的釋放﹝6﹞。代謝和氧化損傷可能啟動澱粉狀蛋白β-分泌酶通路﹝7﹞。β aPPs在神經細胞和膠質細胞中廣泛表達，並以特殊細胞形式進行某些方式的優先表達(如神經細胞內的APP695)。
盡管TGF β、TNF-α和β APP 3者在結構上不相同，而大量的實驗數據表明：在腦損傷中，與細胞反應相一致，其中的每一種細胞因子都起到了關鍵性的和相互制約的作用。在腦缺血和腦創傷興奮性毒素(Excitotoxic)中，這3種細胞因子的應答水平都明顯增高。由于腦缺血，興奮性毒素和腦創傷造成的細胞損傷中一個關鍵問題是誘導性氧化應激反應和體內離子平衡失調。在編碼TGFβ1，TNF-α和β APP基因中的啟動子元件(Promoter elements)相應地將對反應性氧化物(Reactive oxygen species)和鈣激活的轉錄因子(Transcription factors)作出應答﹝8﹞。當腦損傷引起許多不同的神經營養因子和細胞因子作出應答時，這3種細胞因子無論在短期損傷應答和慢性病變過程中都起到了尤為突出的作用﹝9﹞。
在細胞培養中，TGF β，TNF-α和β APP的多效性作用(Pleiotropic roles)可以從不同細胞對這些因子的反應中得到證實。在膠質細胞中，TGFβ1抑制增生而引起神經生長因子(NGF)，表皮生長因子(EGF)和白介素-6(IL-6)的產生，而且還抑制TNF-α的產生﹝10﹞。TGFβ1在體內抑制小膠質細胞的激活作用(超氧化產物和表面抗原表達)以及細胞因子的產生和增生。TGFβ在體外抑制了少突神經膠質細胞祖代細胞的增生，並啟動了包括中腦多巴胺能神經(Dopaminergic neurons)和運動神經在內的CNS不同區域神經細胞的存活﹝11﹞。並且在培養的海馬神經元中引起軸突的外生。TNF-α引起膠質細胞和神經祖代細胞的增生以及膠質細胞中NGF的產生。依靠細胞外蛋白質中的肝素附著區域，β aPP可以影響神經細胞的附著，而sAPP α可能引起包括成纖維細胞在內的非神經細胞的增生，並能啟動大量神經細胞的增殖和軸突的外生。相反，β aPP衍生物A β能損毀和殺傷神經細胞，並能在星形細胞和小膠質細胞中引起反應性表型(Reactive phenotypes)﹝12﹞。
TGF β、TNF-α和β APP不僅各自在腦內能影響多種細胞形式，而且對互相的細胞形式表達也能造成影響。例如，TGFβ1在培養的星形細胞和小膠質細胞能引起全β APP mRNA水平增長6倍﹝13﹞。TNF-α在星形細胞中引起TGFβ的表達，而TGF β卻相反抑制由星形細胞產生的TNF-α﹝14﹞。另一方面，Aβ在星形細胞中引起TNF-α的表達。
2 TGF β、TNF-α和β aPP之間的信號傳導通路
現已確定了3種不同的TGF β受體，分別命名為第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受體，第Ⅰ、Ⅱ型受體介導高化學親和力附著和信號傳導。而第Ⅲ型受體是一蛋白聚糖，可能在將TGFβ傳導到第Ⅰ、Ⅱ型受體中起作用。第Ⅰ、Ⅱ型受體在細胞質的C末端含有絲氨酸-蘇氨酸激酶區(Serine-threonine-kinase domain)。實驗表明，TGF β信號主要通過第Ⅰ，Ⅱ型受體的側突二聚體(Heteromeric dimer)﹝14﹞。TNF-α以相等的親和力附著于兩個獨立的受體----P55和P75，而兩個受體卻以不同的傳導通路相聯系。TNF-α附著于P55受體啟動了一個與膜相連的神經鞘磷脂酶(Sphingomyelinase)，它從神經鞘髓磷脂中釋放神經酰胺(Ceramide)。神經酰胺通過刺激激酶(Kinase)使NFkB化合物的IkB亞單位磷酸化，從而激活轉錄因子NFkB﹝15﹞。非激活狀態時，NFkB由位于細胞質的三個蛋白質構成：P50，P65和IkB。信號通過引起泛素介導(Ubiqintin-mediated)的IkB解離而激活NFkB;P50-P65二聚體易位進入細胞核，與含有特異性kB附著序列的DNA元件結合。相比起來，P75的信號傳導通路不盡確定，但最近的實驗數據提示TNF-α的附著引起了被稱為TRAF1和TRSF2的受體相關細胞質蛋白(Receptor-associated cytoplasmic proteins)的聯系﹝16﹞。
在神經細胞中的特異性sAPP附著點和sAPP在微微克分子(Picomolar)濃集水平影響神經細胞已得到證實﹝17﹞，介導sAPP引起信號傳導的受體卻尚未確定。然而，我們可以從sAPPα的細胞生物學中得到對這種受體本質的啟示。β APP以軸突式傳導並在突觸前端濃集。sAPPα s作為α-分泌酶活化的結果而被釋放，在神經細胞中，可由細胞的活性(如膜的去極化作用)而引起α-分泌酶的活化。最近的研究也提示釋放性sAPPα的分泌機理與TGF α的方式相似﹝18﹞。海馬區對刺激狀態的反應可引起sAPP的最大量釋放，並可引起遞質谷氨酸的釋放，這提示sAPPα的釋放伴有神經遞質的釋放。介導sAPP α活動的信號傳導機制可能包括了一種聯系cGMP水平升高，cGMP依賴性蛋白激酶刺激以及高傳導-敏感K+通道活動的受體﹝17﹞。實驗提示sAPPα受體可能含有內在的鳥氨酸環化酶活性，因為從分離的大腦皮層sAPPα可引起cGMP的產生，而且在正常細胞內這種過程不受一氧化氮合酶阻斷劑的影響﹝19﹞。
3 TGF β、TNF-α和β aPP對CNS的影響
為了研究TGF β1對CNS的影響，在轉基因大鼠的膠質細胞內用膠質纖維酸性蛋白(GFAP)基因過度表達一種TGFβ的生物活性方式。在失控的轉基因大鼠體內，由于星形膠質細胞過度表達TGFβ1，在CNS產生了一種較強的細胞外基質(ECM)高調控蛋白，包括層粘蛋白(Laminin)，纖維粘連蛋白(Fibronectin)，和硫酸肝素粘蛋白(Heparan sulfate proteolycan)。在轉基因純合子與雜合子對應聯系中增高的TGFβ1伴有ECM的表達的進一步的提高。TGF β1表達的膠質細胞鄰近區域(如腦血管和細胞膜週圍)，ECM成分表達增高得尤為明顯。這提示TGFβ1作為ECM成分有力的誘導物，在神經系統病變中起著重要作用。依靠不同的因子，TGFβ1具有前炎症(Proinflammatory)或免疫抑制(Immuno-suppressive)作用﹝3﹞。雖然失控TGFβ1轉基因大鼠沒有CNS炎症浸潤的表現，免疫激發(Immune-challenged)TGFβ1轉基因大鼠對實驗性自動免疫性腦脊髓炎卻顯得更加敏感。與非轉基因大鼠比較，前者臨床症狀表現得更加明顯，在脊髓中單核細胞的浸潤得更為廣泛。在失控狀態的轉基因大鼠研究中，TGFβ1低水平表達的大鼠表現為健康狀態，而高水平表達者卻出現腦積水和神經系統異常表現，並且產後早期就死亡﹝20﹞。值得注意的是，除了TGFβ，TNF-α和β APP以外，還有許多其它細胞因子參與象轉基因這樣的腦損傷反應。例如，大鼠過分表達IL-6將引起嚴重的神經系統改變，如共濟失調，震顫及卒中。它提示了這種細胞因子在CNS中具有較明確的影響。在體內由特異性轉基因產物引起的CNS的改變將主要依靠以下因素：①總的和區域性的轉基因表達的水平；②轉基因產物的細胞來源；③轉基因表達的時間過程；④使用的觀察方法；⑤病理共同因素的存在。雖然尚不能排除體內低水平TGFβ1表達具有神經保護作用，但實驗已表明膠質細胞TGF β1過度表達的許多結果都具有潛在的神經病理作用，高水平TGFβ1過度表達在腦積水的發展中起一定作用，低水平TGF β1過度表達則加重CNS炎症性和澱粉樣病變(Amyloidogenesis)。
從缺乏TNF受體的動物實驗中觀察到TNF-α對腦組織的作用。運用單純缺乏P55和P75受體的純合子雜交技術引起大鼠的兩個受體喪失(TNFR-KO)﹝21﹞。這種大鼠沒有明顯的表型，而對免疫激發應答發生改變。盡管TNFR-KO大鼠沒有明顯的腦組織形態學和行為變化，但已證實對腦損傷有明顯的細胞應答改變。接扎TNFR-KO大鼠大腦中動脈，腦缺血區明顯大于對照組﹝21﹞。損傷TNFP-KO大鼠海馬神經，癜癇病情明顯加重，提示內源性TNF具有神經保護功能。在興奮性毒素和缺血性損傷中，內源性TNF-α的神經保護作用可能有抗氧化劑(Antioxidant)的參與，因為在TNFR-KO大鼠的CA3神經區中由紅藻氨酸(Kainic acid)引起的脂質過氧化物水平高于對照組。此外，在對照組紅藻氨酸引起海馬CA3區Mn-SOD免疫反應性增高，而在TNF-KO大鼠卻無此發現，這提示損傷引起的這種抗氧化酶的TNF-α具有保護作用。
綜上所述，TGF β，TNF-α和β APP作為重要的細胞因子，在腦損傷中，不僅它們的功能和價值有待近一步深入研究，它們的基因表達調控，結構和功能，信號傳遞機制等諸方面也存在著未知的課題。特別是三者之間的信號傳遞調控點的研究發現與腦損傷的發生，發展和結果密切相關。目前某些調節通路雖已明確，但這些因子之間復雜的信號傳遞關系，它們在腦損傷過程中的確切作用以及與其他重要基因產物的關系等研究內容需要更細致和廣泛地探討。
*黎海濤，男，45歲，講師，博士研究生
作者單位：第三軍醫大學基礎醫學部解剖學教研室 重慶，400038
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