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二惡英及其類似物III食品測定方法
中國食品衛生雜志1999年第11卷第5期
吳永寧 趙雲峰
關鍵詞：二惡英 食品 檢驗方法
食品中PCDD/Fs分析屬超痕量(pg-fg)、多組分(同系物、異構體的分離)和復雜前處理技術，對特異性、選擇性和靈敏度的要求極高，成為當今食品和環境分析領域的難點。目前僅在發達國家的少數實驗室能夠開展。WHO指出僅有約100個實驗室具備檢測能力。〔1〕超痕量分析是因二惡英在環境樣品中水平極低，WHO規定的TDI為1～4pg/kgBW；〔2〕相應要求食品中PCDD/Fs測定方法的檢測限以脂肪計低于1pg/g(甚至為fg/g水平的測定)，不到其它污染物含量的1/1000。所謂多組分是指PCDD/Fs中各同系物、異構體的毒性相差很大，具毒性的17種2,3,7,8-取代PCDD/Fs具有毒性，進行危險性評價時需選擇性測定。而PCDD/Fs共有210個同系物、異構體，加上209個PCBs，共有419個二惡英及其類似物。另外，試樣在進行儀器分析前要濃縮至1/1000、1/10000，提取液中的PCDD/Fs比其共提取物和基質中同系物及其它氯代化合物等幹擾組分低得多，使得這一超痕量分析極為困難。只有良好的淨化技術及特異性的分離手段才能滿足要求。〔3～5〕為保證分析質量，國際組織及有關國家建立了官方分析方法與指南，如國際癌症研究中心（IARC）〔4〕、歐盟的公共標準局〔6〕、美國環境保護局(EPA)〔7，8〕和美國食品藥品管理局(FDA)。〔9〕
FAO/WHO食品法典委員會正在著手建立食品二惡英限量標準和相應檢驗方法，起草人認為高分辨氣相色譜與高分辨質譜聯用技術（HRGC-HRMS）是目前唯一適用的的化學方法。而用DNA重組技術建立的生物學方法在二惡英總TEQ水平測定可達到特異性、選擇性和靈敏度的要求，且所測結果與HRGC-HRMS方法相當，可作為大量樣品篩選手段。〔10〕
1 氣相色譜與質譜聯用的化學分析方法
PCDD/Fs的化學分析有兩種不同的方案，一為分析所有PCDD/Fs，目的在于了解各化合物的分布形式，鑑定其可能的來源；另一為僅測定2,3,7,8-取代的17種PCDD/Fs。後一方法較完善，以美國EPA1613方法為代表的HRGC-HRMS方法已成為各國公認的仲裁方法。本文主要以此為基礎對這一領域的進展作簡要綜述。
環境及生物材料中PCDD/Fs的分析主要包括5個方面，即：樣品採集、提取、淨化、分離及定量測定。〔4，6〕
1.1 樣品採集〔4，6〕 與有機氯農藥殘留檢測方法相似，但PCDD/Fs應更注意安全操作和避免試驗過程中的污染。PCDD/Fs具有光解作用，尤其在溶液中低氯代化合物光解作用更為迅速。故樣品應避光、低溫保存。
樣品的取樣量依樣品類型、污染水平、潛在幹擾物質與方法的檢測限而定。一般樣品為1～50g，對于含脂低、污染輕的樣品必要時可增加到100～1000g。
1.2 提取〔4～10〕 提取前，加入13C或37Cl標記的內標，用以測定提取淨化效率與矯正分析丟失。PCDD/Fs的提取方法與有機氯農藥殘留檢測方法相似，包括溶解、振搖、混勻、超聲或索氏提取。提取步驟和溶劑選擇取決于樣品類型和淨化方法。如脂肪和油可採用二氯甲烷+已烷（1+1）直接提取；其它食品可使用不同比例的提取溶劑，採用包括索氏提取在內的各種提取方法。
許多實驗室對比試驗已經表明魚、豬脂肪、牛奶、母乳、人血和脂肪組織所用各種提取方法回收率的可接受性。〔11～15〕作為新技術使用CO2為流體的超臨界流體提取方法，也用于生物樣品中PCDD/Fs的提取。〔16〕
1.3 淨化 淨化目的是除去共提取物中的幹擾組分，淨化程度取決于被測組分的數目、基質幹擾及GC-MS狀態。目前大多採用色譜法進行淨化，包括吸附、分配與排阻色譜。一系列色譜柱，如硅膠加化學改性吸附劑（用硫酸、KOH、CsOH處理的硅藻土及硅膠）、Florisil、氧化鋁、活性碳等，常被串聯使用，多層色譜聯用柱也日益普及。〔17〕
根據樣品類型選擇適當的淨化方法，存在大量共提取物時需要進行預處理。包括酸或堿洗，如用硫酸處理消除油脂等幹擾組分；硅膠柱可吸附脂質及油脂成分，用硫酸、氫氧化鈉和硝酸銀浸泡處理的多層硅膠柱進行洗脫；凝膠滲透色譜也被用來去除脂肪和其它分子量相對較高的化合物。〔4，5〕
微型氧化鋁柱（用一次性玻璃滴管裝柱）可除去提取液中弱極性的氯代苯、多氯聯苯與聯三苯和多氯代二苯醚，這些物質被二氯甲烷+正己烷（1+50）首先洗脫出來，留置柱上的PCDD/Fs再用二氯甲烷+正己烷（1+1）洗脫。這種處理還可除去多氯代-2-苯氧基酚（二惡英的一種前體），以避免其在GC柱上因加熱閉環形成PCDDs的幹擾。〔4〕
80年代中期以來廣泛使用雙柱法，提取液首先經活性炭吸附，用二氯甲烷洗脫，將平面化合物（包括PCDD/Fs）與非平面化合物分離。〔17〕用甲苯對活性炭柱反相洗脫平面化合物，再用氧化鋁柱將PCDD/Fs與其它平面化合物分離(如：非鄰位取代的PCBs、多氯代萘)。此法對復雜生物樣品的分析十分適用，已有自動化儀器商業供應〔4，18〕。近年來也有採用HPLC分離PCDD/Fs的報道，主要用于2,3,7,8-TCDD的定量分析，也用于處理難以淨化樣品分析其它PCDD/Fs。〔13〕
提取、淨化方法的優劣，應以驗證其有效性來確定。通過測定加標樣品及基質空白，可獲得檢測濃度下的回收率。PCDD/Fs分析時至少需要三套標準：一套為17種12C-PCDD/Fs；一套為15種13C-PCDD/Fs的定量內標和2個13C標記的用于確定色譜保留時間的內標；另一套為考察淨化效率的37Cl-2,3,7,8-TCDD標準。
1.4 分離 淨化手段盡管復雜，最終的提取液仍存在氯代化合物的幹擾。這就需要良好分離技術。化學鍵合固定相的HRGC是有效分離PCDD/Fs的唯一選擇。〔13，19〕常用WCOT毛細管柱，長度為15～60m，內徑0.22～0.35mm，內膜厚度為0.15～0.25μm。非極性或弱極性固定相(烷基/芳基硅烷，如OV1、SE30、SE52、SE54、PS255、DB-1、DB-5、OV17-01等)可有效地將PCDD/Fs分離為氯原子取代數相同的化合物的組(如:所有TCDDs和TCDFs及所有PeCDDs和PeCDFs等分離），而極性固定相(氰基硅烷，如silar10c、SP2330、SP2340、CP SIL88等)可將一組中的異構體進行分離。迄今為止，尚未見僅用一根色譜柱即可分離所有同系物異構體的報道。使用歐共體規定使用的非極性色譜柱（如DB-5）分析僅有2,3,7,8-取代的PCDD/Fs，同時使用非極性色譜柱和極性色譜柱（如SP 2331和CPSIL 88）可分離其它位置上氯取代的PCDD/Fs。〔6〕食品中所要測定的是17種2,3,7,8取代的PCDD/Fs，僅採用非極性的色譜柱基本可以滿足要求。〔5〕
色譜柱的柱長、內徑及塗膜厚度決定了操作條件（溫度和載氣流速）及被分析物的保留時間。通過對要定量的17種2,3,7,8取代的PCDD/Fs同系物異構體（13C標記與未標記）標準品比較獲得保留時間。為能準確鑑定被分析組分，校準標準的使用極為必要。應單獨測試每個HRGC系統中同系物異構體的色譜出峰次序（文獻僅作為參考），因此在儀器分析前需要測試柱效的PCDD/Fs標準進行證實，也可使用含已知同系物異構體成分的樣品提取液（如飛灰）。
1.5 定量 要盡量減少化學噪聲和改善檢出限，以保證PCDD/Fs這一類復雜化合物的痕量分析。採用選擇離子監測(SIM)的質譜法，以13C穩定同位素為內標，校正標準測定各個同系物異構體的響應因子和線性範圍。〔5～13〕定量檢測主要採用SIM技術監測氯同位素2個分子離子（M+，M++2）或其它豐度較高離子，同時監測相應的13C穩定性同位素內標氯同位素的兩個分子離子，通過不同窗口對氯不同取代程度的異構體分別定量。這可減少共提取物和其它污染物的幹擾，提高檢測選擇性和靈敏度。所使用儀器包括四極桿低分辨質譜儀（LRMS）、雙聚焦磁式扇形高分辨質譜儀（HRMS）和質譜－質譜串聯（MS-MS）。HRMS通過監測精確質量提供了最高的選擇性，因此HRMS是PCDD/Fs測定的首選儀器。電子轟擊源為PCDD/Fs分析的常用電離方式(EI)。陰離子化學電離(NCI)對高氯取代化合物有更高的靈敏度，但不適合低氯取代的化合物，如2,3,7,8-TCDD的分析。〔5，6〕
MS方法的靈敏度不是由標準溶液的信噪比提供，而是由樣品基質條件下的信噪比決定。LRMS在理論上可以達到檢測要求的靈敏度，但由于復雜基質和共存的PCBs及其它氯代化合物的幹擾，食品中PCDD/Fs低于pg/g水平的分析的靈敏度和其它技術指標都難以達到分析要求。〔4，6，19，20〕為了得到分析食物中TCDDs的準確結果，分辨率在10000以上的HRMS成為唯一選擇。因為TCDD的M+離子m/z為319.8963，而幹擾物二氯二苯基二氯乙烯的M++4離子為319.9321，需要分辨率為9,000的HRMS。雙聚焦磁式扇形HRMS不僅提高了儀器的分辨率，而且提高了信噪比，這意味著化學噪音的降低、靈敏度的提高，〔4〕同時檢測多個離子質量的能力較強，進行SIM時m/z值可長時間不發生漂移，進一步改進信噪比，提供極高的靈敏度，最小檢出限可達10fg，更適合于PCDD/Fs分析要求，為多數二惡英分析實驗室採用。基于HRMS的技術優勢，EPA規定的1613方法採用同位素稀釋法，利用HRGC-HRMS檢測PCDD/Fs。其分析的關鍵點為：用13C同位素內標與樣品前處理同時進行，監測樣品制備的回收率、同位素稀釋的準確度和GC-MS方法的確認。〔21，22〕採用標準考察異構體的GC分離和MS的定性定量的分析質量控制。嚴格控制硅膠、硅鎂吸附劑、氧化鋁、活性炭等的洗提回收。HRMS的分辨率要求在10000以上，保證SIM的靈敏度和穩定性，採用HRGC分離。質量控制措施包括：系統空白、回收試驗、線性範圍、各化合物的保留值窗口、氯取代的同位素峰簇比值、異構體的GC分離、質譜分辨率、信噪比、盲樣核對以及用3個離子定性等。對所有被檢測的離子，確定PCDD/Fs的存在必須要求其信噪比大于3:1，且分子的面積比和標準的離子碎片的偏差應在10%以內，由內標物得到的數據與標準物的偏差應在10%以內，標準物與內標的離子譜圖應一致。〔4〕由于嚴格的分析質量保證體系，1613方法已經成為各實驗室分析工作的基礎。
串聯質譜是另外一種可供選擇的方案。在離子源中形成的離子被第一個質量分析器分離，然後選擇某些離子進行碰撞裂解，再由第二個質量分析器檢測裂解離子。如果第一個質量分析器為扇形HRMS，設定分離PCDD/Fs的M+碎片；第二個質量分析器為四極桿LRMS，分離M+--COCl特征碎片。這樣儀器的選擇性進一步提高，可不通過GC分離直接進樣，快速測定TCDD。〔23〕但這一方法只能測定同系物，不能分離異構體。因此HRGC-MS/MS串聯質譜就成為測定17種2,3,7,8-取代PCDD/Fs的要求，而這一儀器與HRGC-HRMS的購買和維護費用相當、靈敏度是其的1/6，HRGC-HRMS就成為首先選擇。
最近美國FDA研究了利用較便宜的四極離子儲存時間串聯質譜（QISTMS）分析方法。〔9〕採用這一方法可以檢測食品中TEQ低于1pg/g水平的2,3,7,8取代的PCDD/Fs（TCDD為0.2pg/g），分析了包括奶、羊脂、蛋、牛肉、魚和油脂在內的200份物樣品。測定污染樣品雞蛋和鯰魚的結果與HRMS具可比性。FDA正對這一分析方法進一步改進，以期可達HRMS檢測限，來替代HRMS進行食品PCDD/Fs日常監督。〔24〕
1.6 結果報告 測定了17種2,3,7,8-取代的PCDD/Fs含量後，每個同系物異構體的濃度乘以相應的TEF，然後將結果相加。報告的結果就是毒性當量（TEQs）。結果報告時應根據相應的脂肪含量折算成以脂肪計的TEQs。
2 以Ah受體為基礎的生物分析方法
盡管CAC認為HRGC-HRMS是目前唯一適合的分析方法，但由于所使用儀器價格昂貴，試樣需多步分離、淨化步驟十分繁瑣，這一工作在大多數實驗室不能開展。這顯然不能適合食品衛生監督和監測工作的日常需要，國際上有些實驗室試圖建立一種以利用生物傳感器為原理的快速檢測方法。因為Ah受體是PCDD/Fs發揮毒性作用機制的基礎物質，它的被活化程度與PCDD/Fs毒性相一致，而PCDD/Fs活化Ah受體能力與其TEQs有關，目前所建立的生物學篩選方法均據此進行。PCDD/Fs進入細胞漿與Ah受體結合活化後，被Ah受體核轉位因子（ARNT）轉移到細胞核，活化的核內基因是特異性DNA片段-二惡英響應因子（DRE），啟動發揮毒性作用的基因增加其轉錄，如細胞色素P4501A亞型，激活芳香烴羥化酶（AHH）和9-乙氧基-3-異吩唑酮-O-脫乙基酶（EROD）。〔25～28〕以前已經有實驗室用細胞培養通過EROD活性的測定來反應PCDD/Fs激活Ah受體的能力，得到PCDD/Fs的TEQs。〔4,29～32〕為了增加生物學方法的靈敏度，從P4501A1基因5'段分離DRE，並將螢火蟲螢光素酶作為報告基因結合到控制轉錄的DRE上，制備成質粒載體。將這一質粒載體轉染H4IIE大鼠肝癌細胞系（含Ah受體傳導途徑的各個部件），以此構成的CALUX系統螢光素酶誘導活性與PCDD/Fs有關，CALUX相對活性與PCDD/Fs的TEF相一致，所測定的結果就是TEQs。〔33～37〕這一方法已經與HRGC-HRMS化學方法進行對比，結果相當一致。〔37〕然而，採用細胞培養方法仍需要一定條件，同時培養時間多達24h，整個測定多達幾天，不能進行快速檢驗,不適用于食品安全監督檢驗要求。有必要對Ah受體活化程度進行更直接測定。〔38〕在此基礎上進一步改進,以Ah受體、ARNT和DRE為生物傳感器的主要部件，測定轉化的Ah受體。由于Ah受體與ARNT為1：1結合的同源二聚體，這一同源二聚體可以結合在生物素-親和素系統的DRE上，採用酶標雙抗方法測定ARNT，避免了抗體不能區別Ah受體的難點。由于該方法不再需要細胞內的誘導活化過程，體外活化時間由24h減少到2h，加上ELISA檢測，整個分析在1個工作日完成。以Ah受體為生物傳感器建立的免疫生物學方法一次可完成多個樣品的檢測，提取方法相對簡單，所得結果就是TEQs，方法完成後可以滿足衛生監督的大量篩選需要。
由于化學方法是對單個同系物進行測定，結果判定要以每個同系物的TEF乘以含量得到TEQs，所以CAC指出，利用DNA重組技術建立的PCDD/Fs免疫分析和生物分析方法，可以靈敏、特異地檢測出TEQs，適合于大量樣品的篩選。〔10〕但這種方法只能得到一個PCDD/Fs總量（同樣以TEQs表示），而不能了解樣品中PCDD/Fs的具體組成。因此一般認為這類方法可以用作篩選和用于特定條件下的監督管理（如在最近的PCDD/Fs事件中用于檢測進口食品）。在篩選出陽性樣品後，有選擇地用質譜方法檢測。目前尚沒有這一類試劑盒商品正式上市。世界衛生組織正在注視這類方法的開發進展，因為對于廣大發展中國家來說，這類方法十分適用。
3 結語
比利時二惡英污染事件之後，國際社會更加重視食品中二惡英的含量問題。食品中二惡英的檢測技術再次引起世界的關注。HRGC-HRMS是目前唯一適用的選擇方法，串聯質譜方法有可能用于食品中二惡英的檢測，以DNA重組技術建立的生物方法適合于大量樣品的篩選檢查。PCDD/Fs超痕量分析仍很復雜、困難，各實驗室的分析能力及技術存在很大的差異。CAC正加緊制定食品中二惡英限量國際標準的步伐，各國在努力提高二惡英的檢測水平，我國也需要盡快建立國際認可的檢測技術。
基金項目：國家自然科學基金課題
作者單位：中國預防醫學科學院營養與食品衛生研究所(100050)
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