自殺基因治療惡性膠質瘤的研究

　　中國腫瘤臨床1999年第26卷第6期

楊學軍　浦佩玉　姚開泰　曹亞　馬先勇　張雲亭　劉鬆齡

　　 摘　要　目的：單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV－tk）基因治療惡性膠質瘤體內外試驗。方法：分子克隆及真核細胞基因轉染技術構建逆轉錄病毒（RV）載體pMV₇(tk)及PA317tk包裝細胞系；體外不同比例混合鼠C6膠質瘤細胞與PA317tk細胞，在GCV(Ganciclovir)作用下觀察細胞存活率；建立SD大鼠顱內C6膠質瘤模型（種植5×10⁵C6細胞），治療組第3天原位注射5×10⁶PA317tk細胞，5天後腹腔給予GCV(30mg/kg^．d)，MRI全程監測腫瘤消長，觀察病症及存活期，並行病理檢查。結果：在GCV0.1～10¹μg/ml濃度範圍內，C6細胞存活率隨PA317tk細胞混入比例增加而逐漸減低（P＜0.001），並具有GCV劑量依賴性(P＜0.01)；體內試驗治療組病症輕，生存期延長，MRI表明治療組腫瘤體積較對照組明顯減小(P＜0.01)，1個月時病理檢查見腫瘤細胞消失，代之以小膠質細胞增生並形成壞死囊。結論：應用本實驗室構建的RV載體pMV₇(tk)及其PA317tk包裝細胞系治療惡性膠質瘤是一種有效及具有前途的治療方法。

　　關鍵詞：膠質瘤 自殺基因　MRI監測

　　惡性腦膠質瘤是顱內最常見的原發惡性腫瘤，迄今的治療方法都不能從根本上改變這一致命腫瘤的自然轉歸。隨著膠質瘤分子機理的進一步闡明，近年來有關治療的研究日益集中于腦腫瘤的分子外科－基因治療上來。攜帶自殺基因的逆轉錄病毒載體及GCV治療系統是第一個人類膠質瘤體內基因治療計劃^[1]。本研究的目的是應用本實驗室建立的逆轉錄病毒載體及包裝細胞系，系統進行體外及體內治療研究，並用MRI全程監測體內試驗過程。

　　1　材料與方法

　　1.1　RV載體pMV₇(tk)及其包裝細胞PA317tk的構建

　　應用分子克隆技術將2.7kb的HSV－tk基因片段連接在pMV₇載體質粒上，pMV₇(tk)的基本骨架為：5′LTR(MoMSV)－HSV-tk-tk-promoter－NeoR－3′LTR。脂質體法將重組載體轉導入雙嗜性包裝細胞系PA317，定名為PA317tk，Southern與Northern雜交分析證實HSV-tk基因在其中的整合及表達。PA317tk細胞系滿足高病毒滴度（10⁵～10⁶cfu/ml）、無輔助病毒產生的要求。PA317tk細胞產生的病毒顆粒體外感染C6鼠膠質瘤細胞，原位雜交表明HSV-tk基因修飾的C6tk細胞中HSV－tk基因表達良好。

　　1.2　C6與PA317tk細胞體外共培養

　　于96孔板，每孔接種細胞總數為4×10³，按不同比例加入PA317tk細胞（0,10％～100％），每種比例設4孔，5％CO₂，37℃，在含10％胎牛血清的DMEM培養基中共同孵育48小時；加入GCV(0.1,10⁰,10¹μg/ml)，繼續培養96小時，觀察細胞存活率(MTT法)，取均值。

　　1.3體內模擬治療試驗

　　二級實驗動物SD大鼠，雄性，體重150～200g。腹腔注射苯巴比妥30mg/kg麻醉。使用鼠立體定向儀，前囟右旁開4mm，前1mm，進針深度5mm，接種部位相當于右側尾狀核頭部。微量注射持續時間不少于20分鐘，停針5分鐘後退針。模擬治療組：10只鼠，顱內接種5×10⁵C6細胞于20μl無血清DMEM培養基中，第三天顱內原位接種5×10⁶PA317tk細胞于50μl無血清DMEM，再過5天後開始腹腔注射GCV30mg/kg^．d，連續給藥14天。隨機選取2只鼠瘤齡1個月時處死行病理檢查，其餘8只作長期存活觀察。對照組：5只鼠，顱內接種5×10⁵C6細胞，同期等劑量給予GCV。兩組動物均用MRI監測腫瘤的消長，常規T1，T2加權成像掃描及強化掃描（Gd－DTPA:0.2mmol/kg,iv）。觀察鼠的存活期，常規病理檢查及TUNEL法原位凋亡檢測。腫瘤體積=(4/3×π×L×W×H)×1/8。

　　1.4統計方法

　　根據不同資料要求，使用的統計學方法有直線相關分析，方差分析，秩和檢驗，結果以P＜0.05為差別有顯著性，P＞0.05無顯著性。

　　2　結果

　　2.1　C6與PA317tk按不同比例體外混合培養

　　如附表。在GCV0.1～10¹μg/ml濃度範圍內，C6細胞的存活率隨PA317tk細胞混入比例的增加而逐漸降低，兩者在統計學上呈明顯的負相關(P＜0.001)，並具有明顯的GCV劑量依賴性（F=445.56,P＜0.01）。

附表　C6細胞與PA317tk細胞按不同比例混合在GCV作用下細胞存活率觀察(％)

　　2.2體內治療試驗

　　對照組腫瘤細胞接種後出現不同程度的進食、飲水量減少，攻擊性減弱（個別鼠接種早期出現攻擊性增強），隨後出現行走不穩，攝食動作不協調，偏癱，癲癇（僅觀察到1例），瀕死前可出現毛發豎起，呼吸急促，結膜眶週及消化道出血。本組5只鼠生存期均不超過20天，中位生存期為16天。影像學（圖1）及病理組織學檢查表明，C6細胞種植組雖然同樣接受了GCV治療，但在瘤齡兩週行MRI檢查時，顱內仍然可見強化明顯的腫瘤影像。死亡後病理檢查發現腫瘤內有出血和壞死，新生血管活躍，瘤細胞呈假柵欄狀排列並向正常腦組織浸潤，無包膜形成。原位凋亡檢查僅見個別細胞出現凋亡。

圖1　對照組瘤齡2週時強化MRI腫瘤影像(冠狀位)

　　顱內腫瘤C6－PA317tk模擬治療組治療早期可出現上述一般表現，個別鼠出現行走不穩，動作不協調。在瘤齡14天時（包裝細胞接種12天，GCV治療7天）MRI檢查（圖2），與對照組比較 ，兩組間腫瘤體積具有顯著性差別，秩和檢驗P＜0.01。C6－PA317tk模擬治療組在存活30天復查MRI時（圖3），9例中有7例腫瘤完全消失，2例可見殘餘腫瘤（24.98mm³,9.36mm³）。病理學檢查2週時仍可見明顯腫瘤組織，HE切片顯示腫瘤組織中間雜有片狀壞死灶；1個月時腫瘤基本消失，腫瘤部位形成軟化灶，同側腦室擴大，HE切片見病灶中主要為格子細胞及小膠質細胞。治療組長期存活觀察的8只鼠存活均超過90天。

圖2　治療組瘤齡2週時強化MRI腫瘤影像(冠狀位)

圖3　治療組瘤齡1個月時強化MRI表現(冠狀位)

　　3　討論

　　惡性膠質瘤基因治療的策略主要集中在兩方面：創造理想的載體及基因轉移方式；發現並選擇可用于治療的靶基因^[2]。HSV-tk基因作為自殺基因的突出代表^[3]，其開放讀框由啟始密碼子AUG至終止密碼子UGA，共1128個核苷酸，所編碼的HSV-TK酶能夠催化許多核苷類似物（如ACV,GCV,BVdU等）的一磷酸化，然後進一步使之二磷酸化及三磷酸化，哺乳動物細胞內源性TK酶可參與後一過程。所形成的藥物三磷酸毒性分子，可以抑制DNA多聚酶並競爭性的摻入細胞DNA鏈中，使DNA鏈破碎，殺死細胞。哺乳動物細胞的內源性TK，其底物範圍較窄，對GCV的親和力非常低，因而不產生系統毒性。應用攜帶自殺基因的RV載體治療腦腫瘤的優勢在于：RV載體只能在DNA合成活躍的腫瘤細胞中整合及表達目的基因，週圍正常腦組織不能被轉染治療基因，因而不受GCV的影響；惡性腦膠質瘤相對局限，很少遠隔轉移；另外被轉導的腫瘤細胞及RV載體的包裝細胞可以被宿主免疫系統及GCV治療所殺死，消除了插入突變的潛在危險；再者，腦是部分免疫特權器官，可以允許鼠源的包裝細胞存活一定時間以較充分的轉導腫瘤^[4]。

　　在體外試驗中，我們對比鼠膠質瘤C6細胞在轉導HSV-tk基因前後對GCV的敏感性，證實C6tk細胞的半數致死量約為C6細胞的1/1000，原位雜交也證明C6tk細胞中HSV?tk的良好表達（資料本文未包括），這與文獻報道基本一致^[5]。將C6細胞與PA317tk細胞按照不同比例共培養，發現C6細胞的存活率與混入PA317tk細胞的比率成負相關，並在GCV有效濃度內（0.1μg/ml～10μg/ml）具有明顯的劑量依賴性。

　　本試驗所建立的SD鼠顱內C6膠質瘤模型，腫瘤免疫組織化學染色均有GFAP及S100蛋白的表達，說明了腫瘤膠質細胞來源性未變^[6]。本模型成瘤時間短，瘤細胞呈假柵欄狀排列，新生血管活躍，腫瘤內有出血和壞死，向正常腦組織內浸潤生長，無包膜，符合腦腫瘤的病理狀況。我們全程採用高分辨率MRI監測治療組與對照組顱內腫瘤消長，冠狀及矢狀薄層掃描直觀了解腫瘤影像，並常規行T1、T2加權及強化成像檢查。每只鼠在MRI片上不僅注明編號還標記治療組別、檢查日期，並與相應病理組織學檢查發現對照，使試驗結果更加嚴格準確。

　　向腦腫瘤內移植在一段時間內（一般7～14天）可以持續產生病毒的包裝細胞來增加瘤床中可被利用的載體總量來解決病毒滴度低的問題是一種重要的治療策略^[7]。我們在顱內也注射了10倍于初始瘤細胞數目（5×10⁵）的包裝細胞，原位雜交結果雖然顯示有部分腫瘤細胞未能被轉移治療基因（資料本文未包括），但治療組腫瘤植反應輕微，1個月時腫瘤可達影像學消失，病理反應以膠質細胞增生為特點，生存期明顯延長，而對照組病症逐漸加重，出現偏癱、癲癇、結膜及消化道出血，存活均不超過20天．

　　基因治療所應用的載體、腫瘤模型、治療基因的表達情況都會影響到最終的基因轉移率^[8]，雖然改造載體、引入強啟動子上調治療基因的表達不失為一種嘗試，但在目前尚無其它良策進一步提高基因轉移率的情況下，治療模式的優化成為又一研究領域．

參考文獻

　　1 Oldfield EH. Gene therapy for the rteatment of brain tumors using intra-tumoral transduction with the thymidine kinase gene and intravenous ganciclovir.Hum Gene Ther,1993;4:39

　　2 Liau LM,Black KL.Gene therapy for malignant glioma.Crit Rev Neurosurg,1996;6:178

　　3 Rogulski KR,Kim JH,Kim SH,et al.Glioma cells transduced with an Escherichia coli CD/HSV-1TK fusion gene exhibit enhanced metabolic suicide and radiosensitivity.Hum Gene Ther,1997;8:73

　　4 楊學軍，浦佩玉．膠質瘤基因治療的基因轉移系統及旁效應機制．國外醫學神經病學神經處科學分冊，1997;24:116

　　5 Barba D,Hardin J,Ray J,et al.Thmidine kinase-mediated killing of rat brain tumors.J Neurosurg,1993;79:229

　　6 Peterson DL,Sheridan PJ,Brown WE Jr.Animal models for brain tumors:historical perspectives and future directions.J Neurosurg,1994;80:865

　　7 Takamiya Y,Short MP,Moolten FL,et al .An experimental model of retrovirus gene therapy for malignant brain tumors.J Neurosurg,1993;70:104

　　8 楊學軍，浦佩玉．神經膠質瘤基因治療的載體研究進展．中華神經處科雜志，1997;13(5):306

　　作者單位：楊學軍　浦佩玉 天津醫科大學總醫院神經外科(天津市　300052)

　　姚開泰　曹 亞　馬先勇湖南醫科大學腫瘤研究所

　　張雲亭　劉鬆齡 天津醫科大學總醫院放射科