|
胚胎肢芽內神經營養活性物質的提純及其生物活性的研究
中華手外科雜志 1998年第4期第14卷 基礎研究
作者：洪光祥 劉紅光 王發斌 何善述
單位：洪光祥 劉紅光 王發斌 430022 武漢,同濟醫科大學附屬協和醫院手外科；何善述 同濟醫科大學生化教研室
關鍵詞： 胚胎；神經生長因子；神經元
【摘要】 目的 研究從胚胎肢芽內提取和純化具有神經營養活性的物質。方法 剖腹取胚齡為10～15天的SD大鼠胚胎,將其肢芽連同基部剪下、剪碎。勻漿離心後取上清液超濾,分別收集大于10 000KD的組分和小于10 000KD的組分。然後將大于10 000KD的組分用高速蛋白液相層析系統分離,得5個蛋白組分,即＞300 000KD、21 0000KD、95 000KD、34 000KD和22 000KD組分。再將這5個組分連同小于10 000KD的組分,分別加至胚鼠背根神經節感覺神經元的培養基中,培養24小時後用MTT法測定神經元的活性。結果 95 000KD、34 000KD和22 000KD 3個組分對神經元有營養活性。其中22 000KD的活性較弱,95 000KD和34 000KD的活性較強。此外,22 000KD、34000KD和95 000KD合在一起的活性明顯強于任何單一組分。結論 胚胎肢芽內含有較強的促進神經元活性的神經營養活性物質,為神經營養因子提供了新的來源。
Extracting and purification neurotropins from embryonic limb buds and study of their activity HONG Guangxiang,LIU Hongguang, WANG Fabin,et al. Department of Hand Surgery,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022
【Abstract】 Objective To extract and purify neurotropins from limb embryonic buds and study their bioactivity.Methods SD rats embryoes at the age of 10～15 days were obtained by cesarean section.Limb buds with their bases were cut off,and put in homogenizer for homogenating.After centrifugation, the supernate was ultrafiltrated and passed HPLC molcular column. The proteins in limb buds were then separately components of ＜10 000KD, 22 000KD, 34 000KD,95 000KD,210 000KDand ＞
300000KD. Each of them was seperately added into the medium of rat embryonic sensor neurons from dorsal root ganglia. After having been cultured for 24 hours, the neurons'surviving activity was examined by MTT method.Results The components of
22 000KD, 34 000KD and 95 000KD have neurotrophic activities,and the activity of component 22 000KD being weak， the other two are strong.In addition, the mixture of these three components has the highest activity.Conclusions Neurotrophic substances with high activity are present in limb buds,and limb buds may become a new source of neurotrophic factors (NTFs).
【Key words】 Embryo Nerve growth factors Neurons
自本世紀50年代發現神經生長因子(NGF)以來,探索神經營養活性物質的研究一直是週圍神經學領域內的熱點。迄今為止,雖然從多種神經靶器官和膠質細胞等處獲得了多種神經營養因子﹝1,2﹞,而且取得了很大的進展,但仍不能使神經損傷後的功能恢復到滿意程度。肢芽是週圍神經發生的搖籃,其內必然含有多種神經活性成分,維持和促進週圍神經的生長發育。我們在研究中也發現,胚胎肢芽的提取物對體外培養的神經元具有較強的神經營養活性﹝3﹞。為進一步探索從其內提取和純化具有神經營養活性的物質,我們進行了下面的實驗。
材料與方法
一、抽提大鼠胚胎上清液
剖腹取胚齡為10～15天的SD大鼠胚胎68只,切取其肢芽連同肢芽發出的胚胎基部,立即投入-196℃的液氮中迅速冷凍。充分剪碎後,按每克組織加入2ml(30mmol/L)的醋酸銨緩衝液進行勻漿,勻漿物先以6 000轉/分的轉速于4℃離心60分鐘,然後取上清液在30 000轉/分的轉速下于4℃離心4小時,收集第2次所得的上清液。
二、分離純化
將上清液用不同濃度的硫酸銨溶液進行分級沉澱,沉澱物經上述緩衝液溶解後,置于4℃冰箱中透析過夜。上Sephadex G-100柱(2.5cm×50.0cm),用0.01mol/L,pH 7.0的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗脫,流速為0.01 L/小時。 洗脫後得三部分,收集第二部分用PM 10超濾,然後分別收集大于10000KD的組分和小于10 000KD的組分。再將大于10 000 KD的組分用高速蛋白液相層析系統(Parmacia)分離,洗脫液仍為上述PBS,流速為1ml/分。結果顯示:相對分子量大于10 000KD的蛋白峰有5個,出峰時間分別為10.38分、16.86分、18.35分、22.78分和23.99分。與標準樣蛋白出峰時間對照得出的相對分子量為＞300 000KD、210 000KD、95 000KD、34 000KD和22 000KD。用紫外分光測定其濃度分別為0.086 g/L、0.028 g/L、0.059 g/L、0.064 g/L和0.047 g/L, 小于10000KD組分的濃度為0.067 g/L。用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌後,分裝于無菌小瓶中,于-70℃保存備用。
三、神經營養活性分析
取胚齡為14天的SD大鼠胚胎28只,于手術顯微鏡下摘取其神經節,剔除外膜,剪碎後分別用0.25%的胰蛋白酶和0.01%的Ⅳ型膠原酶消化(37℃,5%CO2,飽和濕度)20分鐘,吹打分散細胞,然後離心(1 000轉/分,5分鐘),細胞沉澱加Eagle培養基溶解成細胞懸液,過200目不鏽鋼網,用差速粘附法純化神經元﹝2﹞。細胞計數並調整至50萬個/ml,混勻後,吸取150 μl至96孔培養板,分別加入＞
300 000KD、210 000KD、95 000KD、34 000KD和22 000KD,＜10 000KD和95 000KD，34 000KD和 22 000KD的混合組分,依次分為8組,每組10孔,分6次進行實驗。每次加樣量為50 μl,蛋白含量每ml為10 μg、20μg、40 μg、80 μg、160 μg和320 μg;對照組加50 μl的PBS,培養24小時後用微量自動比色法﹝3（4,5 dimethly-thiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT﹞測定神經元的活性﹝4﹞,並進行t檢驗分析。
結 果
培養24小時後,用MTT法測得反映神經元活性的OD值見表1。
表1 MTT法測得反映神經元活性的OD值
| 加樣量ng/ml |
＜10KDa |
22KDa |
34KDa |
95KDa |
210KDa |
＞300Kda |
22、34、95KDa |
PBS |
| 10 |
0.098±0.020 |
0.121±0.030 |
0.175±0.018 |
0.156±0.034 |
0.105±0.013 |
0.094±0.013 |
0.190±0.021 |
0.096±0.014 |
| P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
-- |
| t1=0.07 |
t1=1.67 |
t1=7.37 |
t1=3.40 |
t1=0.69 |
t1=0.54 |
t1=8.21 |
-- |
| P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＞0.05 |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
| t2=4.67 |
t2=1.25 |
t2=1.91 |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
| 20 |
0.101±0.012 |
0.144±0.027 |
0.243±0.027 |
0.192±0.020 |
0.092±0.011 |
0.106±0.016 |
0.241±0.026 |
0.100±0.017 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.05 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＜0.05 |
P1＜0.01 |
-- |
| t1=0.12 |
t1=3.28 |
t1=10.71 |
t1=8.41 |
t1=0.83 |
t1=0.74 |
t1=10.91 |
-- |
| -- |
P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＜0.01 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| -- |
t2=5.80 |
t2=0.10 |
t2=3.39 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| 40 |
0.103±0.019 |
0.157±0.035 |
0.278±0.034 |
0.245±0.028 |
0.099±0.013 |
0.112±0.011 |
0.300±0.027 |
0.102±0.015 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.05 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
-- |
| t1=0.26 |
t1=3.25 |
t1=10.55 |
t1=9.98 |
t1=0.12 |
t1=1.66 |
t1=14.03 |
-- |
| -- |
P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＜0.05 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| -- |
t2=7.21 |
t2=1.16 |
t2=3.23 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| 80 |
0.089±0.013 |
0.180±0.021 |
0.307±0.026 |
0.281±0.034 |
0.090±0.012 |
0.103±0.018 |
0.348±0.029 |
0.093±0.015 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
-- |
| t1=1.06 |
t1=5.09 |
t1=14.91 |
t1=10.70 |
t1=1.05 |
t1=0.25 |
t1=16.60 |
-- |
| -- |
P2＜0.01 |
P2＜0.05 |
P2＜0.05 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| -- |
t2=10.61 |
t2=2.36 |
t2=3.36 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| 160 |
0.100±0.019 |
0.191±0.021 |
0.346±0.030 |
0.318±0.035 |
0.099±0.014 |
0.089±0.009 |
0.389±0.029 |
0.090±0.010 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＞0.01 |
-- |
| t1=0.04 |
t1=7.51 |
t1=15.98 |
t1=12.61 |
t1=0.12 |
t1=0.13 |
t1=19.20 |
-- |
| -- |
P2＜0.01 |
P2＜0.05 |
P2＜0.01 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| -- |
t2=12.29 |
t2=2.89 |
t2=3.39 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| 320 |
0.104±0.019 |
0.193±0.018 |
0.345±0.026 |
0.303±0.025 |
0.095±0.016 |
0.100±0.017 |
0.359±0.033 |
0.095±0.013 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
-- |
| t1=0.34 |
t1=8.06 |
t1=17.84 |
t1=15.08 |
t1=0.44 |
t1=0.02 |
t1=15.64 |
-- |
| -- |
P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＜0.05 |
-- |
-- |
-- |
-- |
| -- |
t2=9.55 |
t2=0.76 |
t2=3.01 |
-- |
-- |
-- |
-- |
注:P1、t1為與PBS對照的P值、t值; P2、t2 為與
22 000、34 000、95 000KD混合組分對照的P值、t值
討 論
胚胎學研究表明,週圍神經的發育始自肢芽階段,由脊髓基板和脊神經節內的神經元發出胞質突向肌節和皮節延伸,然後逐漸長入皮膚和肌肉,並進一步分化發育成熟。這充分說明肢芽內含有多種促進軸突生長,維持神經元存活的神經營養活性成分構成神經生長發育的微環境。有研究表明神經生長因子(NGF)和神經生長因子低親和性受體(P 75 NGFR)的基因表達始自肢芽階段﹝5﹞。Henderson等﹝6﹞的研究表明促進運動神經元存活的神經營養因子(GDNF)存在于肢芽內,而且它在肢芽內的表達比腦組織還要多﹝7﹞。另有研究認為肢芽內的糖蛋白(tenascin),以及免疫球蛋白樣分子L 1,N-cAM,MAG,PO和細胞外基質糖蛋白(laminin)等對週圍神經的生長發育起十分重要的作用
﹝8﹞。但目前國內外尚未見有從肢芽中提取這些活性物質來研究治療週圍神經損傷的報道。我們在多年來一直從事週圍神經損傷研究的基礎上,借鑑神經生長因子和雪旺細胞源性神經營養活性物質研究的經驗﹝1，9﹞,設計了本實驗。旨在用現代較為先進的分離純化和鑑定神經營養活性因子的新方法,來探索從大鼠胚胎肢芽中提取和純化具有較強神經營養活性的因子。
結果表明,從胚胎肢芽提取物中純化出來的分子量為22 000KD、34 000KD和95 000KD的蛋白組分可以促進背根神經節感覺神經元的活性,而且這種活性在160 000μg/L的範圍內表現最突出。除22 000KD的活性較弱外,95 000KD和34 000KD的活性都特別強。按照Walike﹝10﹞的研究,它們具有神經營養活性。此外,還發現22 000KD,34 000KD和95 000KD合在一起的活性明顯強于上述任何單一組分。這可能是因為3個組分所起的作用及作用途徑各不相同,合在一起就出現了活性疊加的原因,同時它們又是構成週圍神經生長發育微環境的主要成分,當加進該神經元的培養基後,它們同樣能形成維持神經元存活的微環境。其具體機制尚需進一步研究。
神經營養因子(NTFs)是維持神經元存活,促進其生長發育及軸突再生的重要因素。除NGF以外,近年來已從中樞神經系統和神經靶器官等處獲取了多種神經營養因子,主要有腦源性神經營養因子(BNTF),睫狀神經營養因子(CNTFs),骨骼肌源性神經營養因子(MNTF)和雪旺細胞源性神經營養因子等﹝1﹞。這些神經營養因子有著不同的作用範圍和活性,有一些已經成為藥品並應用于臨床。本研究首次從大鼠胚胎肢芽中提取和純化具有較強神經營養活性的因子,從而為獲取神經營養因子增加了一種新的的來源,也必將為研究治療神經損傷,提高神經再生的速度和質量開闢新的前景。至于每一組分的進一步純化及其生物學活性的特點,有待于深入研究。
本課題為衛生部科研基金、湖北省自然科學基金資助項目
參考文獻
﹝1﹞高貴,朱家愷,顧雄飛,等.雪旺氏細胞源神經營養蛋白的純化及其體外生物活性的研究.中華顯微外科雜志,1996,19:115-118.
﹝2﹞Van Eldik LJ. Neurotrophic activity of S-100B in cultures of dorsal root ganglia from embryonic chick and fetal rat. Brain Res,1991, 524:280-284.
﹝3﹞劉紅光,洪光祥,王發斌.胚胎肢芽提取物對體外培養的背根神經節感覺神經元的作用.中華手外科雜志，1997,13:239-242.
﹝4﹞Hohn A, Leibrock J, Bailey K, et al. Identification and characterization of a novel member of the nerve growth factor/brain derived neurotrophic factor family. Nature,1990,344:239-241.
﹝5﹞Wheeler EF, Bothweel M. Spastic temporal patterns of expression of NGF and the low-affinity NGF receptor in rat embryoes suggest functional roles in tissue morphogenesis. J Neurosci,1992,12:930-945.
﹝6﹞Henderson CE, Camu W, Mettling C, et al.Neurotropins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb bud.Nature,1993,363:266-270.
﹝7﹞Choi Lundberg DL, Bohn MC. Ontogeny and distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA in rat. Brain Res Dev Brain Res,1995,85:80-88.
﹝8﹞Martini R.Expression and functional roles of neural cell surface molecules and extracellular matrix components during development and regeneration of peripheral nerves. J Neurocytol,1994,23:1-28.
﹝9﹞方煌,吳洋管,龐清江等.從牛精漿中提純神經生長因子的生物活性檢測.中國修復重建外科雜志,1993,7:32-34.
﹝10﹞Walike PA. Novel neurotrophic factors receptors and oncogens. Ann Rev Neurosci,1989,12:103-126.
（收稿：1998-05-15 ）
|
