CNTF和NGF在損傷後變性神經組織中的表達與分布

中華顯微外科雜志 1998年第2期第21卷 基礎研究

作者：顧曉鬆　嚴志強　範明　曹錚　張沛雲　譚湘陵

單位：226001 江蘇南通市，南通醫學院神經科學研究所(顧曉鬆，嚴志強，曹錚，張沛雲，譚湘陵)；北京軍事醫學科學院(範明)

　　關鍵詞： 神經退行性變；神經再生；睫狀節神經營養因子；神經生長因子

　　【摘要】 目的：揭示睫狀節神經營養因子（CNTF），神經生長因子（NGF）在損傷後變性神經組織中的表達與分布。方法：以5例成人正中神經切割傷後2～3個月的神經為材料，取損傷處的近、遠側端，冰凍切片，用特異性抗CNTF、抗NGF抗體免疫化學反應，ABC系統顯色。計算機圖象處理技術定量測量陽性免疫反應強度與面積，對照組採用正常正中神經。結果：在神經損傷後的近、遠側端中的CNTF含量明顯高于正常組，CNTF位于增生活躍的雪旺細胞內。NGF在近、遠側端中的含量均高于正常組，NGF主要分布在部分神經纖維的軸索中。結論：CNTF與NGF在切割傷後的神經遠側端發生退行性變化的神經組織中仍可表達，呈向上調節趨勢。通過神經趨化因子的表達，為神經再生與功能修復提供合適的微環境。

　　 　THE EXPRESSION AND DISTRIBUTION OF CNTF AND NGF IN DEGENERATING NERVE AFTER LESION Gu Xiaosong，Yan Zhiqiang，Fan Ming，et al. Institute of Neuroscience.Nantong Medical College.Nantong 226001

　　【ABSTRACT】 Objective：To study the expression and distribution of CNTF and NGF in degenerating nerve.Methods：Both proximal and distal stumps of transected median nerve from 5 cases as well as normal median nerve，were fixed and sectioned.The sections were separately reacted with CNTF and NGF antibodies，and visualized by ABC method.The area and content of positive-immunoreactivity were measured by computer image processing system.Results：The area and content of CNTF of distal and proximal stumps was higher than that of normal median nerve, CNTF-immunoreactivity was seen at the proliferating Schwann cells with strong immunostaining. NGF was found in axon area of the fibers of distal and proximal stumps and it could not be observed in Schwann cells.Conclusions：The up-regulation of the synthesis and secretion of CNTF and NGF in distal stumps with nerve degeneration strong indicated that the distal segment of an injured nerve provides a supportive environment for axonal regeneration by the expression of neurotrophic factors.

　　【KEY WORDS】 Nerve degeneration Regeneration CNTF NGF Human

　　近年來的研究資料提示，在中樞與週圍神經系統的發育過程中，靶器官影響著軸索生長方向與選擇支配，其可能的機制是靶源性的化學信號誘導著軸突的生長方向，這現象稱為化學誘向性（Chemotropsim）。週圍神經損傷後，其神經元的存活及軸突的再生有賴于多種神經營養因子。神經橫切傷後，其遠側端發生潰變。在這一時期中，神經營養因子是否得以表達正是神經再生研究中的一個重要方面。本研究採用免疫組化方法探索CNTF 和NGF在神經再生過程及在損傷後變性神經組織中的表達與分布，為探討神經再生的機制和神經營養因子在臨床的應用提供科學依據。

材料與方法

　　5例成人的正中神經新鮮材料，均為神經幹橫斷切割傷後2～3個月，術中分別取神經橫斷傷後近、遠側端(約10　mm）。立即投入4％多聚甲醛固定液中，4℃，72小時，冰凍切片，片厚25 μm。免疫組化步驟如下：第1步：兔抗CNTF 10 μg／ml，室溫下12小時；第2步：生物素化羊抗兔IgG（Vector）室溫下2小時；第3步：ABC復合物（Vector）室溫下1小時；第4步：在DAB液中顯色2～3分鐘。陽性產物呈棕色。每步間用Tris緩衝液洗3次。每次3分鐘。NGF免疫組化方法是，小鼠抗NGF 20 μg／ml（BMB），室溫下1小時，APAAP 25 μg／ml（BMB）室溫下1小時；快紅（Fast Red）基質液呈色反應，室溫下10 min，陽性產物呈紅色^〔1〕。

　　對照組採用1％BSA緩衝液代替初級抗體液。實驗過程中將近、遠側端的神經切片與正常神經組織切片裱在同張載玻片上進行免疫組化反應，以保證各組間的實驗條件相同。

　　計算機圖像處理系統由AST386／25和PCVISION PLUS圖像卡(美國Imaging技術公司)及專用軟件組成。依據CNTF陽性免疫反應的圖象灰度選擇合適的灰度分割閾值，實現雙閾值分割。得到樣品的半灰度目標圖象，以人機交互方式測定損傷神經近、遠側端及正常正中神經CNTF陽性免疫染色強度及面積。每組取5例，每例測2張切片。由計算機打印出所測CNTF陽性反應物相對含量的灰度值及面積。經統計學t檢驗各組之間CNTF相對含量是否存在差異。

結果

　　用免疫組化ABC技術顯示正常神經組織，損傷神經近、遠側端均出現CNTF陽性反應。正常組織橫斷面觀察，陽性反應產物為瘦月牙形圍繞軸突及髓鞘，軸突及髓鞘呈陰性，陽性反應產物佔據面積較小。縱切面觀察，陽性反應產物呈線條狀，位于神經纖維週邊，陽性反應產物呈色較弱。在神經損傷後的近、遠側端均出現較強的CNTF免疫陽性反應，近側端的陽性反應程度更強于遠側端。陽性反應產物位于部分有髓纖維週邊的雪旺細胞胞漿內，這些細胞體積大，核深染呈增生活躍狀態，神經橫切面觀察陽性反應產物則以胖月牙形或呈暈狀環繞髓鞘，髓鞘及軸突呈陰性，但偶爾可見極度增生的雪旺氏細胞包繞的軸突，其軸區可見CNTF陽性反應產物，陽性免疫反應產物佔據面積較小(圖1，2)。縱切面觀察陽性反應產物呈粗曲線狀排列在神經纖維週邊。圖象定量分析結果表明：正常週圍神經CNTF免疫反應灰度平均值157.23±9.767，陽性免疫反應產物面積為10.10±3.77　μm²；損傷神經近側端免疫反應灰度平均值為131.77±11.31，面積為229.04±89.13μm²；損傷神經遠側端免疫反應灰度平均值144.30±11.43，面積為223.86±69.42μm²(圖3，4），統計學t檢驗表明：正常神經與損傷後神經CNTF陽性反應產物的面積存在有顯著性差異(P＜0.01）。

　　圖1　再生正中神經近側端橫切面。ABC方法。陽性CNTF免疫反應產物位于部分雪旺細胞胞漿(▲)。標尺＝10μm。

　　圖2　再生正中神經遠側端橫切面。ABC方法。陽性CNTF免疫反應產物位于部分雪旺細胞胞漿(▲)。標尺＝10μm。

　　 　　NGF的陽性反應產物出現在近、遠側端的部分纖維中。高倍鏡下見分布在軸區。而在雪旺氏細胞中尚未能見到NGF陽性反應產物。NGF陽性反應的強度在近、遠側端實驗組中的差異並不顯著。但近、遠側端組中的NGF陽性反應強度明顯高于正常組。

討論

　　CNTF在週圍神經主要位于形成髓鞘的雪旺氏細胞胞漿內。新近研究表明，　CNTF于生後亦見表達，其含量隨著神經的生後發育而有所變化，以1個月齡鼠最高，2個月齡次之，3個月齡最低^〔2～4〕。週圍神經損傷導致Wallerian變性，引起雪旺細胞功能改變，使之從維持髓鞘結構及軸突完整性轉變為再生支持細胞。Sendtner及Smith等研究顯示，在損傷大鼠坐骨神經後的早期，先是損傷處遠側端的CNTFmRNA然後是CNTF蛋白質的表達呈進行性下降，這種下降是以離心方式向遠側端進行的。而在近側端CNTF的表達只有輕度下降^〔5，6〕。在神經再生過程中，CNTF的表達則呈逐漸上升趨勢，到第60天，已達到或超過正常水平。本研究發現在人神經損傷後2個半月的標本中，不論是近側端還是遠側端，CNTF免疫陽性染色強度明顯強于正常神經，尤其反應面積遠遠大于正常神經，這提示相對于一個雪旺細胞而言，損傷神經CNTF的表達要明顯高于正常神經。CNTF呈強陽性反應，這表明雪旺細胞增生活躍和CNTF含量增加(呈向上調節)是與神經纖維的再生同步的。進而發現，神經斷裂後的遠側端仍可測得CNTF的表達，而且陽性反應產物明顯強于正常組。這一結果提示神經損傷後，導致了不僅僅是在組織病理學方面的Wallerian氏潰變，而是一個復雜的細胞學和生物化學的對損傷與再生反應性調控過程，特別是在蛋白質表達方面發生著明顯的變化，如有些因子在正常情況下不表達或低表達，當損傷刺激後即處于高表達狀態^〔7〕，在遠側端發生退行性變的神經組織中，通過產生CNTF、NGF等因子為支持軸突再生，重新建立軸突與雪旺細胞的聯系，以及對靶區的再支配，提供合適的環境。

　　　　　灰度值

　　正常N　157.23±9.767

　　近側端　131.77±11.31

　　遠側端　144.30±11.43

3　CNTF陽性免疫

　面積(μm²)

　　正常N　10.10±3.77近側端

　　229.02±89.13遠側端

　　223.86±69.42

4　CNTF陽性免疫反

　　反應產物灰度值應產物面積（μm²)

　　NGF在遠、近側端中均可表達，這提示NGF可能由神經細胞胞體合成後，向外週輸送或由軸突衍生的靶器官部位的某種細胞合成後向心性輸送。顯而易見，CNTF與NGF在正常神經組織中處于不表達或低表達的狀態，因子含量很低。當神經損傷之後的再生時期，盡管遠側端已發生退行性變，CNTF與NGF的表達仍可明顯高于正常狀態。這一現象提示：遠側端中的CNTF與NGF在神經再生與修復過程中起著重要作用。若在治療神經系統疾病和神經損傷病例中，使局部和遠側端中CNTF和NGF表達增強或添加CNTF和NGF，可為神經再生，為提高神經生長速度創造良好的條件。

　　本文受國家傑出青年科學基金資助

參考文獻

　　1　Cordell J，Falini　B，Erber　WN，et　al. Immunoenzymatic labeling of anti-monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal antialkaline （APAAPcomplexes）.J Histochem Cytochem，1984，32：219-225．

　　2 Ip NY，McClain J，Barrezueta NX，et al.The α component of the CNTF receptor is required for signaling and defines potential CNTF targets in the adult and during development.Neuron，1993，10：89-97．

　　3 嚴志強，曹錚，顧曉鬆，等.睫狀神經節神經營養因子在大鼠坐骨神經生後發育中的表達----免疫組織化學研究.解剖學報，1995，26：19-23

　　4 Dobrea GM，Unnertall JR，Rao MS.The expression of CNTF message and immunoreactivity in the central and peripheral nerve system of the rat.Develop Brain Res，1992，66：209-215．

　　5 SmithGM，Rabinovsky ED，MCmanaman JL，et al. Temporal and spatial expression of ciliary neurotrophic factor after peripheral nerve injury.Exp Neurol，1993，121：239-245．

　　6 Sendtner M，Stockli KA，Thoene H.Synthesis and location of ciliary neurotrophic factor in the sciatic nerve of the adult rat after lesion and during regeneration.J Cell Biol，1992，118：139-143.

　　7 Xiaosong Gu，PK Thomas，RHM King. Chemotro-pism in nerve regeneration studied in tissue culture.J Anat，1995，186：153-163.

(收稿：1997-05-14，修回：1997-09-04)