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β地中海貧血的基因治療
中華血液學雜志
CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY
1999年第20卷第10期Vol.20No.10 1999
鄒奕 杜傳書
關鍵詞：β地中海貧血 基因 治療
β地中海貧血(地貧)是一種常見的單基因遺傳病，迄今已發現100多種突變類型，致使β珠蛋白合成減少或完全不能合成，從而導致過剩的不穩定的α鏈形成。β地貧臨床表現程度各異，但大多數重型β地貧都要靠輸血維持生命，一方面給家庭和社會帶來巨大的經濟負擔，另一方面長期輸血不能根本治愈患者，並造成一系列與輸血有關的疾病，如鐵貯積、免疫反應、病毒感染等，最終威脅患者的生命。所以人們寄希望于基因治療。β珠蛋白基因定位、結構明確，對相應的調控基因了解較清楚，因此β地貧是最早被嘗試用于基因治療的疾病之一。但由于珠蛋白基因的紅系組織特異性和發育階段特異性以及表達調控的復雜性，使其離成功還相當遙遠。
廣義的基因治療包括直接基因治療和間接基因治療。
1 直接基因治療
對β地貧的直接基因治療最早可追溯至1980年，當時將正常的β珠蛋白基因直接注入2例β地貧患者的骨髓細胞，然後再回輸患者體內，但經過一段時間的臨床觀察，未取得治療效果。盡管有了初次的失敗，但由于逆轉錄病毒運載的珠蛋白基因在MEL細胞培養體系中的成功表達，以及轉入的外源人β珠蛋白基因使β地貧小鼠的症狀得到改善，這些都使人們對直接基因治療充滿了信心。但十幾年來，由于外源基因在體細胞內表達水平低，達不到治療效果，能表達外源基因的細胞數少，在跟蹤觀察中這些細胞還會減少,因此如何提高轉化效率，提高病毒滴度和外源基因的表達，純化可長期增殖、保持其數量的造血幹細胞（LTRA）,成為人們重新估價β地貧直接基因治療的主要因素。
直接基因治療的基本模式是：①構建運載目的基因的逆轉錄病毒載體；②前病毒的DNA整合到包裝細胞基因組中；③通過選擇包裝細胞得到有一次性感染能力的高滴度的病毒顆粒；④病毒顆粒感染靶細胞，經逆轉錄後前病毒DNA整合到宿主基因組DNA中，目的基因在相應的靶細胞中得到表達﹝1﹞。載體的基本結構包括病毒表達、包裝、整合的基本序列和目的基因及其啟動子和調控序列，而病毒的Gag，Pol，Env編碼序列缺失，這樣就阻止了野生型病毒的產生，而包裝細胞則提供形成病毒顆粒所必需的由這些序列編碼的蛋白質。在載體上加入的抗新霉素基因或編碼特殊膜表面蛋白的基因，使得可以通過G418培養基或免疫學方法選擇能產生高滴度載體的細胞系，然後以高滴度的、整合穩定的重組體感染 MEL細胞。然而感染的效率，整合過程中的重排，錯誤剪切等都影響了珠蛋白基因的表達水平。在動物實驗中，外源基因很難長期存在並表達﹝2﹞，說明感染的細胞中，真正長期增殖,並保持其數量的造血幹細胞較少，外源基因的表達水平很難達到內源性鼠βmajor珠蛋白基因的5%。
紅系特異增強系位點控制區(LCR)的發現和研究為提高珠蛋白基因的表達提供了新的可能性。LCR是由位于β珠蛋白基因簇上遊的一系列對Dnase Ⅰ高敏感的位點組成(Hypersensitive sites 1～5，HS1～5)﹝3﹞，全長超過20kb。LCR具有兩種互相獨立的作用：增強子作用和位點非依賴作用。在動物試驗中，LCR可大大增加外源珠蛋白的表達，並不受整合位點的影響，表達水平只與整合基因的拷貝數有關。除HS1外,其餘HS位點均有增強子的作用，5個HS位點能協同增強基因表達的功能。HS2和HS3被認為是最有活性的片段，HS2和HS3上能保證其功能的最小核心部分分別是0.4kb的HindⅢ至XbaⅠ之間的片段和225bp的HphⅠ至Fnu4HⅠ之間的片段，但各HS位點間的連接序列對于它們之間的協同作用是不可缺少的。β珠蛋白LCR這兩種作用的作用機制都尚未清楚。在轉基因鼠中，LCR調控元件中不同的HS位點賦予了基因不同的表達模式﹝4﹞，HS3似乎與胚胎型ε珠蛋白基因表達相關，HS4與β珠蛋白基因表達相關。Louis-Guy等﹝5﹞在將β LCR與LacZ基因順式連接的轉基因鼠的試驗中發現，LCR增強基因表達的作用並非如以前研究﹝6﹞認為的那樣通過二元機制（即有或無）的方式起作用，而是以一種漸變的作用方式增強基因表達,而其位點非依賴作用的實現則需要至少3個以上的HS位點及β珠蛋白基因簇附近的側翼序列。LCR究竟是改變了染色體的結構而導致染色體特定部位的開放，還是封閉了整合位點週圍基因的負性效應,這些問題仍在研究之中。但β LCR嚴重影響病毒重組體的滴度，導致缺失和重排。有研究表明，β珠蛋白基因IVS-Ⅱ中的A/T豐富區與341bp5′ HS2中的A/T豐富區有協同作用﹝7﹞，能降低病毒滴度和整合穩定性。因此如何去除β LCR中影響病毒穩定性的序列，而又不影響其活性也是當前載體構建中的一大難題。
1996年Ren等﹝8﹞構建的N2A-γ載體含有人γ珠蛋白基因和α LCR(主要包含255bp的HS40)，此N2A-γ載體在5′與3′端的LTR(Long terminal repeats)內均含有α LCR，這樣α LCR可以從兩邊消除整合位點附近的幹擾。此載體感染3種包裝細胞：GP+envAM12、PA317和GP+E86均獲得較高滴度，重組率在3個細胞系均小于25%，在MEL細胞中，γ珠蛋白基因也有較高表達。
除了逆轉錄病毒載體外，腺相關病毒載體（AAV）也越來越受到人們的重視﹝1﹞。AAV載體主要有3個優點：①無病理作用；②宿主範圍廣泛，可感染靜止期的細胞；③可高效率整合到人類19號染色體的特定位點（19q13,3-qter）。Selvarangan等﹝9﹞報道的其構建的含人β LCR HS2、β珠蛋白基因啟動子和Aγ珠蛋白基因的腺相關病毒載體，感染B6(Hbbd/Hbbd，Gpi-Ⅰa/Gpi-Ⅰa)小鼠的骨髓造血幹細胞，移植入C57BL/6J(Hbbs/Hbbs，Gpi/-Ⅰb/ Gpi-Ⅰb)小鼠體內，人Aγ珠蛋白基因在小鼠體內表達達到了小鼠內源性β-actin基因表達水平的4%～6%。
最理想的基因治療方法為用同源重組進行基因置換，但如何提高正確位點的同源重組率，以及在此之後的細胞的篩選和克隆都是尚未解決的難題。當人們看到離直接基因治療的成功還有相當長的路程時，間接基因治療又重新受到了重視。
2 間接基因治療
2.1 反義核苷酸技術:
有相當一部分的β地貧是由于轉錄過程中的錯誤剪切造成的，如IVS-Ⅰ-110G→A，IVS-Ⅱ-654C→T。反義核苷酸是一段與錯誤剪切位點互補的多聚寡核苷酸，可封閉前mRNA上的錯誤剪切位點，從而加工出正常的mRNA。將編碼反義核苷酸的基因序列轉入造血幹細胞，並使其受到α珠蛋白的調節元件及 LCR HS40的控制，使α珠蛋白基因的表達與反義核苷酸的表達相平行。在體外培養的細胞中，反義核苷酸能100%糾正錯誤剪切。Sierakowska﹝10﹞等設計的針對IVS-Ⅱ-654突變的18bp的2′- O-甲基寡核苷酸與5′錯誤剪切位點有較高親和性，正確剪切的β mRNA從第6小時後開始出現並持續至46小時，含量達到了β mRNA的44%，在試驗中，反義核苷酸顯示了高度的特異性，對細胞生長也無不良影響。國內亦有應用體外轉錄和體外剪切系統﹝11﹞，以體外轉錄產生的特異反義RNA封閉IVS-Ⅱ-654C→T突變基因中3′隱匿剪切位點和5′異常剪切位點，減少異常加工的mRNA，使正常mRNA水平由25%上升到46%～60%。
2.2 紅細胞生成素(Epo)：
在臨床治療中，Epo能改善鐮形細胞貧血以及β地貧患者的症狀，促進β和γ珠蛋白基因的表達。但Epo達到治療效果的劑量大、費用昂貴，限制了在臨床上的應用。Villeval等﹝12﹞以改建後的MPZen2逆轉錄病毒為載體，將猴Epo基因轉入β地貧小鼠的造血幹細胞，明顯提高了β地貧小鼠的血細胞比容，β/γ值接近正常。但轉Epo基因的表達水平難以控制，不是太高，就是太低，以及有可能造成致死性的紅細胞增多症，現多將Epo與其它藥物配伍使用。
2.3 藥物治療：
γ珠蛋白基因在成人後被關閉，若能重新激活γ珠蛋白基因，增加HbF的合成，就能在功能上代償患者體內β珠蛋白不足的情況。5-氮胞核苷、羥基尿、丁酸鹽都曾被用來治療β地貧，而羥基尿作為一種低毒、有效的α珠蛋白基因的激活劑，在動物試驗中被證實確有增加HbF合成的功能，並在長期臨床用于鐮形細胞貧血的治療中取得了較好的療效﹝13-15﹞。γ珠蛋白基因的表達水平存在著遺傳性差異﹝16﹞，Benin、Bantu和Senegal是鐮形細胞貧血最常見的3種單倍型。在Senegal單倍型中，出現于Gγ基因5′端的 XmnⅠ識別位點，常導致Gγ的高表達和高水平的HbF。Lu等﹝17﹞檢測了β LCR HS2中5′端從8543～9165的約520bp，β LCR HS3從4436～5005約550bp的片段，以及位于β珠蛋白基因上遊的(AT)x(T)y重復序列、AγT基因上遊-222.0到-225.5的4bp的缺失、G γ和A γ珠蛋白基因的啟動子序列、G γ基因上遊約162bp的框架結構及A γ基因中IVS-Ⅱ等這些位點的多態性，在這些順式作用因子中未發現某種多態與HbF的調控有關，因此認為在γ珠蛋白基因的表達調控中其它順式作用因子和反式作用因子可能起著更為重要的作用。在HEL細胞中，羥基尿誘導參與紅細胞成熟分化的因子GATA-1和NF-E2的表達﹝18，19﹞，並能顯著誘導β珠蛋白基因mRNA的合成，提示羥基尿可能通過誘導某些轉錄因子和參與某些信號傳遞途徑促使β珠蛋白基因表達。在羥基尿治療β地貧患者的臨床觀察中，患者對羥基尿的反應程度和速度差異非常大，因此認為這種差異性也受遺傳因素的影響。以前人們認為在γ珠蛋白基因啟動子中的CpG二核苷酸的甲基化導致了基因的關閉﹝20﹞，羥基尿通過降低這種甲基化程度導致基因轉錄的增加，但現在研究表明並不盡然，羥基尿還能糾正某些剪切缺陷﹝21﹞，促進正常剪切的β mRNA的合成，這說明羥基尿有著更為復雜的影響細胞分化和調控基因表達的機制。患者對羥基尿治療反應的速度和程度各不相同。Olivieri﹝22﹞和Arruda﹝23﹞都有取得了相當好的療效的報道。Steinberg﹝24﹞研究了143例羥基尿治療的鐮形細胞貧血患者，發現治療前粒細胞與網織紅細胞計數高的患者對羥基尿的反應較好，HbF升高幅度大。總之羥基尿的作用機制有待進一步研究。
3 其他
能高效轉染的、高滴度的，且沒有逆轉錄病毒和AAV載體缺點的理想的病毒載體的研制仍然是目前研究的難點，人工染色體的使用則避免了外源基因與宿主基因組的整合，這些都將是以後幾年研究的熱點。能長期增殖並保持其數量的造血幹細胞的分離以及體外擴增，仍有待解決。由于我們無法預期成功的直接基因治療何時能實現，間接基因治療和綜合治療在相當長一段時間內仍是當前不可忽視的減輕患者痛苦、延長患者生命的有效手段。
作者單位:鄒奕 杜傳書 510089 廣州,中山醫科大學醫學遺傳學教研室
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收稿:1998-09-07 修回:1999-02-10
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