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急性早幼粒細胞白血病發病及誘導分化機制研究進展
中華血液學雜志CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY
1999年第20卷第12期vol.20No.12 1999
劉廷析 茅矛 陳竺 王振義
關鍵詞：急性早幼粒細胞白血病（APL） 誘導分化 治療
急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是臨床上第一個應用誘導分化治療取得成功和第一種針對腫瘤特異性標志分子進行治療的人類惡性腫瘤。95%以上APL患者具有特征性的非隨機染色體t（15；17）。該易位使15號染色體上的早幼粒細胞白血病（PML）基因與17號染色體上的維甲酸受體α（RARα）基因發生融合，表達PML-RARα融合蛋白﹝1﹞。少數變異型APL患者產生t（11；17），該易位使11號染色體上的早幼粒細胞白血病鋅指（PLZF）基因與17號染色體上同樣的RARα基因發生融合，表達為PLZF-RARα融合蛋白﹝2﹞。在APL發病機制中，應注意此兩種融合蛋白分別與野生型PML或PLZF、RARα蛋白共存于APL細胞中。研究表明，PML-RARα或PLZF-RARα融合蛋白可顯性失活（dominant negative）野生型PML或PLZF蛋白的功能和幹擾正常RARα信號傳導，因而研究融合蛋白如何影響PML蛋白正常功能及RARα信號傳遞成為理解APL發病及誘導分化機制的關鍵。
1 PML蛋白的正常功能及融合蛋白對PML蛋白功能的影響 早期體外轉染實驗表明，PML具有增殖抑制活性﹝3﹞。Wang等﹝4﹞以敲除（knockout）PML基因小鼠作為體內研究模型，發現純合缺失PML鼠(缺失兩個PML基因)有如下特征：①外週血成熟粒細胞（中性、嗜酸、嗜堿、單核）顯著低于正常鼠；骨髓、肝、脾、淋巴結成熟粒細胞顯著減少；②小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embyonic fibroblast, MEF)增殖率和3H-TdR摻入率顯著高于正常鼠，而雜合缺失(僅缺失一個PML基因)PML鼠居中；③MEF克隆形成能力增強，S期細胞顯著增多，G0或G1期細胞顯著減少；④在誘變劑DMBA和TPA作用下，純合缺失PML鼠皮膚發生更多的乳頭狀瘤。研究表明，PML蛋白抑制增殖的機制是通過阻滯細胞週期實現的。將PML基因轉染乳腺癌細胞，Le等﹝5﹞發現cyclin D1、CDK2表達顯著下調，P53、P21WAF1/CIP1表達上升，Rb蛋白去磷酸化，導致細胞阻滯在G1期。Wang等﹝4﹞進一步發現維甲酸(RA)信號通路可能需要PML蛋白的增殖抑制活性。在甲基纖維素培養體系中，正常鼠的造血前體細胞形成紅系、髓系集落的數量在加入RA後明顯增加，但純合缺失PML鼠則無此效應。同時，作者發現1 μmol/L RA可誘導正常MEF細胞表達P21WAF1/CIP1，而缺失PML的MEF細胞則無，說明PML介導RA依賴的P21WAF1/CIP1表達。由于P21WAF1/CIP1能誘導造血細胞分化﹝6﹞，因而PML的功能缺失可解釋APL情況下的分化阻滯。上述結果表明，PML蛋白至少部分地參與RARα/RXR信號傳遞。
PML蛋白的功能發揮與它在細胞內的定位密切相關。在正常細胞，PML蛋白以不連續點狀方式（speckled pattern，punctate pattern）分布在細胞核內，電鏡下呈0.3～0.5 μm直徑，且與核基質相關的致密圈餅樣結構結合稱為核體（Nuclear bodies, NB）或POD（PML Oncogenic Domain）結構，正常細胞核約含10～30個﹝7﹞。POD結構實質上為多蛋白復合體，除PML蛋白外，尚含SUMO-1﹝8﹞、pRb﹝9﹞、SP100﹝10﹞、rfp﹝11﹞、NDP55、ISG-20等蛋白成分。其中一些是自身免疫性疾病如原發性膽汁性肝硬化患者的核抗原﹝7﹞。應用酵母雙雜交系統，最近發現POD結構的另一個新成員是SUMO-1（Small 1 Ubiquitin-Mediated Protein）﹝8﹞。SUMO-1屬泛素相關蛋白Sentrin家族成員。實驗證明SUMO-1參與PML基因的翻譯後修飾過程，並因此介導PML蛋白的細胞內定位﹝8,12﹞,主要依據有：①在表達PML蛋白的Hela細胞和COS細胞，免疫沉澱試驗發現SUMO-1與PML蛋白形成共價復合物，該結合是可逆的，且依賴磷酸化發生；②採用免疫熒光雙標記發現幾乎所有POD結構內均含有SUMO-1蛋白和PML蛋白；③在非APL細胞，未經SUMO-1修飾的PML蛋白彌散分布于核基質中，而被SUMO-1修飾的則定位于POD結構。用As2O3處理PML細胞4小時後彌散性熒光完全消失，代之以POD結構增多、擴大，提示As2O3能使彌散性分布的SUMO-1和PML共定位于POD結構中﹝8﹞。NB4細胞（含PML-RARα）經RA和As2O3各處理24小時、2小時後，Western blotting顯示PML-RARα融合蛋白完全降解， POD結構的正常定位分別于24～48小時、3～6小時完全恢復，該時相特點提示：RA和As2O3通過降解PML-RARα釋放被“扣押”的PML，繼而被SUMO-1修飾再回到POD結構中。值得注意的是，PML-RARα也能與SUMO-1形成復合物，但與PML不同，SUMO-1化的PML-RARα被迅速降解，降解機制不清﹝8﹞。Kamitani等﹝12﹞認為，PML-RARα（長型、短型）均不能被SUMO-1修飾，因而不參與PML-RARα的降解。最近，利用減數文庫技術，我們發現在NB4細胞中SUMO-1可被1 μmol/L RA上調，支持SUMO-1參與PML-RARα降解及POD結構恢復這一推測。目前，尚不清楚As2O3是否調控SUMO-1表達。
POD結構中另一重要成員是低磷酸化的pRb蛋白，是第一個被認識的腫瘤抑制基因，通過“扣押”一組E2F轉錄因子而控制細胞週期G1-S轉換。pRb亞細胞定位類似于PML，即呈彌散和顆粒狀（POD樣結構）分布，這一特點促使Alcalay等﹝10﹞研究二者的可能結構和功能聯系。應用免疫沉澱及免疫雙重熒光疊加(Superimposition)實驗，他們發現：①在體外，PML與pRb形成復合物，出現共沉澱；②以野生型pRb和PML基因轉染U937細胞，80%以上含PML的POD結構與pRb定位在同一部位，而pRb家族其他成員（如P107、P103）則無此現象；③在NB4細胞，盡管POD結構解體，但PML／pRb仍共同定位于APL細胞特有的異常微顆粒樣（microspeckles）結構中。進一步使用不同的缺失突變體，發現pRb“袋區”（pocket region）中703～737氨基酸為結合所必需（該區也是E2F轉錄因子的結合部位），而PML中多個結構域參與結合，其中N-末端B盒和C-末端為結合所必需，環指（ring finger）、Coiled-coil區進一步加強結合。由于PML-RARα也能有效地結合pRb，但缺乏不同長度的C-末端區，推測尚存在其他結合方式。功能上PML-RARα可能通過影響pRb定位，幹擾其增殖抑制功能而參與APL發生。
最近發現，Sp100的另一個選擇性剪接成分Sp100-HMG也定位于POD結構內，Sp100是最早發現的POD結構成員，而Sp100-HMG具有非序列特異的DNA結合能力，在被共轉染的Hela細胞，Sp100、Sp100-HMG具有轉錄抑制活性，提示POD結構參與染色質水平上的轉錄調控﹝9﹞。
上述結果表明，作為功能性多蛋白復合體，POD結構通過“扣留”多種重要的胞內調節蛋白而影響細胞基本的病理生理過程。不僅在APL，多種DNA病毒如單純皰疹病毒Ⅰ型、腺病毒E4等也影響POD結構分布，用抗病毒藥物幹擾素處理後，PML的表達及POD數量、大小增加﹝13﹞。Muller等﹝8﹞認為正常細胞內兩種形式的PML定位（彌散型和POD結構）存在動態平衡，POD結構可能是PML以及其他重要功能蛋白的貯存形式，在PML-RARα以及病毒感染等因素影響下，POD結構解體，其內容物釋放，引起異常的細胞病理過程。
2 PML-RARα對RARα/RXR信號傳導的影響 核激素受體RARα是配體依賴性的轉錄激活因子。正常情況下，RARα功能的最佳發揮有賴于與另一類維甲酸受體RXR 形成異二聚體。在RA（配體）缺乏時，RARα/RXR異二聚體的轉錄靜默效應通過與一組輔助抑制因子（corepressors）,如SMRT(silencing mediator for retinoid and thyroid-hormone receptors)、N-coR(nuclear receptor corepressor)、mSin3形成復合物，再募集(recruit)組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)，後者使核小體組蛋白 (H2,H3,H4) 氨基-末端賴氨酸殘基去乙酰化而帶正電，並與帶負電的DNA 結合，保持染色體的致密卷曲結構從而抑制轉錄﹝14-16﹞。在生理濃度（10-8mol/L）RA存在時，RA與RARα上配體結合區（E區）結合，導致構象改變，N-coR復合物從RARα上解離,進而募集輔助激活因子（coactivators）復合物，包括CBP/P300、P/CAF、NcoA-1/SRC-1、P/CIP等﹝15﹞。其中CBP/P300和P/CAF具有強烈的組蛋白乙酰化酶活性，乙酰化組蛋白賴氨酸殘基使之帶負電而與DNA相斥，染色質結構舒展而激活轉錄﹝17﹞。
在APL細胞，PML-RARα或PLZF-RARα均能通過形成同二聚體或分別與RXR形成異二聚體結合在維甲酸反應元件(RARE)上，幹擾RARα/RXR信號傳導。 臨床上，凡具有PML-RARα蛋白的APL細胞只對藥理濃度RA（10-6～10-7mol/L）起反應，而具有PLZF-RARα的APL細胞反應很差﹝18﹞，提示RARα、PML-RARα、PLZF-RARα三者發揮轉錄功能對RA濃度的依賴性不同，依次為PLZF-RARα＞PML-RARα＞RARα。由于三者具有相似的RA結合能力﹝19﹞，推測這一差別的原因跟它們與輔助抑制因子結合特性不同有關。應用細胞轉染和免疫沉澱實驗，幾組作者﹝20-23﹞同時發現，生理濃度的RA（10-9～10-8mol/L）使RARα結合的N-coR解離，但不影響PML-RARα/N-coR復合物穩定性。藥理濃度RA（10-7～2×10-5mol/L）可使PML-RARα/N-coR完全解離，但即使在最高濃度RA（2×10-5mol/L）作用下，仍有30% PLZF-RARα/N-coR復合物存在。進一步發現，與PML不同，PLZF能與N-coR形成復合物，即PLZF-RARα中有兩個N-coR結合位點，分別位于PLZF和RARα上；而PML-RARα中，僅有一個位于RARα上。由于各自與N-coR親和力不同，構成它們對RA反應性不同的基礎：即RARα最弱，生理濃度RA使之解離；PML-RARα次之，藥理濃度才能使之解離；PLZF-RARα最強，藥理濃度僅能使之部分解離或者不解離。親和力增高的原因，除N-coR結合位點增加外，也可能與PML或PLZF對RARα的構象效應有關。此外，另一輔助抑制因子SMART也有類似的結合動力學特征﹝24﹞。結構上，RARα上的N-coR結合位點位于E區N-末端，稱為CoR-Box；PLZF上的CoR-Box位于N-末端BTB/POZ區，而N-coR上2158～2239氨基酸序列最有利于結合PLZF。我們知道具有POZ結構的另一轉錄因子bcl-6也通過BTB/POZ與輔助抑制因子結合，提示核激素受體、含POZ鋅指蛋白通過輔助抑制因子調控轉錄是一個普遍機制﹝20﹞。
輔助抑制因子N-coR/SMART/mSin3復合物通過募集組蛋白去乙酰化酶抑制轉錄這一現象，進一步被HDAC抑制劑Trichostain和丁酸鈉(sodium butyrate, NaB)效應所證實。50 nmol/L TSA能部分（50%）解除PLZF-RARα/N-coR的轉錄抑制效應，並誘導PLZF-RARα轉染的U937細胞分化; 200 nmol/L TSA能部分恢復RA誘導NB4-R(RA抵抗細胞株)細胞的分化。由于是部分解除，提示除HDAC外，尚有其他因子參與轉錄抑制﹝21﹞。此外，PML-RARα中RARα上的CoR-Box若發生突變，喪失N-coR結合能力，也可解除PML-RARα的分化阻滯效應﹝22﹞。
不同轉錄因子的信號途徑可通過利用共同的輔助抑制因子或輔助激活因子而相互關聯。如CBP(CREB-binding protein)不僅作為RAR的輔助激活因子，也為CREB、AP-1、Stat-1等轉錄因子所必需﹝25,26﹞，因而RARα途徑的激活可能幹擾CREB、AP-1、Stat-1等依賴的轉錄途徑，相應地抑制cAMP、Ras、IFN-γ等信號路徑﹝20﹞。同樣，Mad/Max異二聚體對靶基因的轉錄抑制也需要N-coR/ mSin/ HDAC，因而PML-RARα可通過競爭性利用N-coR/ mSin/ HDAC復合物而抑制Mad/Max信號途徑﹝27﹞。
3 結語 日益增多的證據表明，PML/PLZF-RARα對POD結構及RARα信號傳導的幹擾是APL發病機制的重要基礎。從APL細胞POD結構在RA和砷劑應用前後的分布及其內容物之間相互關系的改變來看，可見POD結構在維持細胞增殖、分化、凋亡平衡中起著重要作用。 很多DNA病毒感染也與POD結構改變密切相關，幹擾素處理使POD數量、大小增加。目前尚不能理解這些復雜現象背後有無共同本質。輔助抑制因子的介入能很好解釋融合蛋白對靶基因的轉錄調控特性，但PML-RARα/PLZF-RARα對N-coR親和力的不同可能不是唯一解釋RA反應性不同的基礎。PML-RARα中E區點突變可能介導APL對RA發生耐藥﹝28﹞；RARα-PLZF依靠PLZF的7個鋅指而具有轉錄調節活性，這也可能成為對RA耐藥的重要機制﹝29﹞。進一步明確在APL發病機制中哪些基因被抑制，換句話說，哪些基因能被RA直接開啟而使APL細胞分化，將成為下一步工作的重點。
作者單位：200025 上海第二醫科大學附屬瑞金醫院
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收稿：1998-09-24 修回：1999-06-03
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