活化的蛋白C拮抗與血栓形成的分子機制

　　國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊1999年第20卷第6期

　　深圳市人民醫院檢驗科（518020） 徐勇綜述

　　重慶醫科大學檢驗系 康格非審校

　　摘要 活化的蛋白C拮抗（Acivated Protain C resistance, APC-R）是由于APC無法正常、有效地水解、滅活FⅤa，使得凝血酶原酶復合物、凝血酶生成增加、造成體內高凝狀態。目前發現的大部分APC-R是由于遺傳性因素引起，即由于FⅤ的單點突變（FⅤR⁵⁰⁶Q）使其對APC的水解產生拮抗而又保留有促凝活性。遺傳性APC-R與人體靜脈血栓形成有關，但二者相關性因地域、人種不同而有較大差異，其臨床表現也因人而異。獲得性APC-R逐漸引起重視，但其與臨床疾病的相關性及發生機制尚待深入研究。

　　關鍵詞：活化的蛋白C拮抗；血栓形成；基因突變

　　目前對大部分靜脈血栓發生的原因尚不十分清楚，但可以肯定與遺傳因素有關，因為40％以上的血栓性疾病病人有家族史。然而現已發現的遺傳性抗凝因子缺陷發生頻率較低，不足以解釋遺傳性易栓症的發生機理。1993年有了歷史性的突破，荷蘭的Dahlback等^[1]報道了一種新的遺傳易栓症----活化的蛋白C拮抗（Activated protein C Resistance, APC-R），並在1994年由Bertian等證實是由于FⅤ基因單點突破（FⅤR⁵⁰⁶Q，又稱FⅤ leiden）所致^[2]，近幾年來對這方面的研究逐漸增多並獲得了眾多新發現。本文將就APC-R發生的分子機制，其與血栓形成的關系及其臨床表現作一綜述。

　　1 APC與人體抗凝系統

　　1.1 FⅤ、FⅧ與人體血凝系統 人體在生理狀態下，血液促凝/抗凝系統保持平衡，但偏向抗凝以使人體血液循環通暢。而在血管損傷部位抗凝系統下調，促凝系統佔優勢以利于止血。產生于血管損傷部位的凝血酶可使FⅤ、FⅧ激活，同時使血小板聚集活化；並使纖維蛋白原轉變為不溶性的纖維蛋白網絡。FⅤa、FⅦa結合于激活的血小板表面暴露的帶負電的磷脂並作為FⅨa、FⅩa的受體位點。FⅨa和FⅩa是蛋白水解酶，由FⅦa-TF復合物水解相應的酶原而產生。FⅨa和FⅩa之間的膜結合物有效地激活FⅩ，從而構成“Ⅹ復合酶”（Ⅹ ase complex或tenase）復合物。類似地，FⅤa和FⅤa形成“凝血酶原酶（Prothrombinase）”復合物，從而產生凝血酶。人體的凝血反應是一個高效的酶促反應過程，失控的促凝反應將變成對人體的威脅。為了對付這一個潛在的威脅，人體內凝血酶可作為一個天然抗凝系統----蛋白C（ProteinC pC）系統的啟動因素，此時凝血酶從一個促凝因素變成一個依賴于內皮細胞的抗凝因素：在完整血管處產生的凝血酶結合于內皮膜蛋白----TM而激活蛋白C，TM是內皮細胞上凝血酶的受體，是凝血酶的強力調節劑和激活PC的輔助因子；活化的蛋白C（APC）通過有限的蛋白水解而滅活膜結合的FⅤa和FⅧa，這個反應可被蛋白S（PS）及未激活的FⅤ加強。

　　1.2 PC、PS與FⅤa滅活 pC為維生素K依賴性蛋白，與FⅦ、FⅨ及FⅩ有同源性，有共同的調節組成：（從N端開始）一個維生素K依賴性γ-羧基谷氨酸（Cla）富有區；兩個EGF樣片段；一個絲氨酸蛋白酶（SP）調節子。血漿中大多數PC以雙鏈形式存在，其輕鏈含Gla和EGF片段，重鏈含SP調節子。在凝血酶-TM復合物激活下，一個12aa的激活肽從重鏈N端釋放，SP調節子轉變成為一種活性酶，形成APC；APC高度特異地水解切割FⅤ及FⅦa上有限數目的肽鍵，但APC只特異地切割滅活膜結合型FⅤ和FⅧa，而對于循環中的FⅤ和FⅧa幾乎無影響。未激活的FⅤ與具同源性的FⅧ有共同的調節子排列：A1，A2，B，A3，C1，C2。凝血酶或FⅩa激活FⅤ後，切割三個肽鍵：Arg709(A2-B)；Arg108(B)；Arg1545(B-A3)。活化的FⅣa由重鏈（A1＋A2）和輕鏈（A3＋C1＋C2）組成，由Ca²⁺依賴性肽鏈結合在一起。FⅧ的激活稍有不同：切割發生在A1－A2，A2－B，B。APC對二者的切割均在A1－A2內，FⅤa為Arg306，Arg506，Arg679；FⅧa為Arg336，Arg562。APC切割後，FⅤa和FⅧa失去抗凝活性。

　　APC單獨抗凝活性極低，只有在蛋白S（PS）和FⅤ的輔助下其抗凝活性才可有效表達。目前，未激活的FⅤ作為APC輔助因子的作用機理尚不清楚^[5]。

　　pS也是維生素K依賴性血漿蛋白，與其它維生素依賴性促凝因子不同的是，它不是一個絲氨酸蛋白酶。PS作為APC輔助因子的機制尚不完全清楚，有人提出PS提出通過促進APC與磷脂表面的結合以及清除針對APC水解FⅤa、FⅧa的FⅤa、FⅨa依賴性的保護作用而發揮作用。最近有人提出PS的輔助作用是發生于FⅤa上的Arg306切割而不是Arg506切割，加之FⅤa對Arg506的保護作用，提示Arg306是凝血酶原復合物中調節FⅤa活性的關鍵位點。現認為FⅤa在Arg506的迅速水解切割有助于Arg306的緩慢水解，Arg306的切割使得FⅤa活性徹底喪失^[3]。也有報道PS通過直接作用于FⅤa、FⅩa及磷脂表面而直接抑制凝血酶原酶的激活，從而發揮非APC依賴性的抗凝活性。

　　pC、PS的雜合子缺陷與靜脈血栓發生有相關性；2％～5％的血栓病與之有關。人群中的PC缺乏發生頻率約為1/300，血栓患者中PC缺陷發生頻率升高10倍。PS缺陷在人群中的發生頻率仍未知，但家族研究提示PS缺陷相關的靜脈血栓形成與PC缺陷相似。PC、PS純合子缺陷常在新生兒時即表現為嚴重的、致死性的血栓形成，顯示PC系統在調節血液凝固中的作用。

　　2 FⅤ突變與APC拮抗的產生

　　fⅤ：Q⁵⁰⁶突變使APC三個切割位點之一的Arg506丟失，Arg506的Km較Arg306低10倍，二者的Vmax相似，使得二位點的切割依賴于FⅤa的濃度。正常的FⅤa濃度下，Arg506的切割比Arg30快10倍，FⅤa：Q⁵⁰⁶的活性被抑制的速度比FⅤa：R⁵⁰⁶低10倍，使產生的FⅤa維持更長的時間並與FⅩa形成凝血酶原活性復合物，從而導致凝血酶生成增加和高凝狀態。Arg506突變不影響FⅤ轉變為FⅤa，故患者的促凝活性是正常的。

　　很早就知道FⅩa保護FⅤa免受APC的降解，現在發現這是由于選擇性保護Arg506位點；此外有報道PS作為APC輔助因子是由于作用于Arg306位點切割而不是Arg506。故APC介導的遊離FⅤa降解與凝血酶原酶復合物中的FⅤa降解是通過不同的途徑；為抑制凝血酶原酶復合物中的FⅤa，Arg306切割較Arg506更重要，故當FⅩa或TF途徑啟動凝血反應時FⅤa：Q⁵⁰⁶與FⅤa：R⁵⁰⁶的抑制速度幾乎相同。這也可以解釋遺傳性APC-R表現型較溫和。

　　據國外資料報道，95％左右的APC抗性是由FⅤ的單點突變（FⅤ：Q⁵⁰⁶）所致^[2]，未帶有FⅤ：Q⁵⁰⁶等位基因的血栓病人偶爾也發生APC-R，提示APC-R也可能由其它未證實的機制引起；1998年分別在香港和英國劍發現了兩種Arg306突變Arg306→Gly和Arg306→Thr^[4,5]，這一方面證實了Arg³⁰⁶APC一切割位點在調節凝血酶原酶復合物中的重要作用，同時也提示可能有多種基因突變影響FⅤ的關鍵位點而導致APC-R。上述兩個位點的突變與APC-R發生率及靜脈血栓形成的關系，尚需在世界範圍內進一步研究。目前的研究顯示FⅤ突變在歐洲的白種人中發生率較高，而在亞、非、澳、美洲的原居民中較少發現，有明顯的種族差異。我國近年有少數幾例FⅤ突變的報道^[6]，但缺乏一般情況介紹和家族調查數據。香港發現的Arg306→Gly突變，可能值得在中國人中進行新的調查研究。

　　西方國家FⅤ：Q⁵⁰⁶的發生頻率很不平衡；南瑞典地區血栓病高發區的FⅤ突變率高達15％；其他歐洲國家也有較高的發生率。如德國、希臘等國可高達10％；在荷蘭、英國和美國則為3％～5％；而在意大利、西班牙則較低，為2％左右；中東地區的阿拉伯人和猶太人也可見FⅤ變異。甚至在同一國家內也有很大的變異，如在法國Lille地區為1％，而在Straburg為10％^[7]。

　　3 遺傳性APC拮抗與靜脈血栓形成

　　遺傳性因素在血栓形成病理中很重要，現已觀察到在40％的血栓病人中有家族史，但促使血栓發生的遺傳性因素仍未完全澄清，在大多數的血栓病人中，只有10％的靜脈血栓病人帶遺傳性的抗凝因子（如AT、PC、PS）缺陷。APC-R的發現使遺傳性易栓症的機理研究邁進了一大步，目前已出現了一大批APC-R與靜脈血栓危險因素增高的報道，但由于所選擇的病人標準和人種的差異，所報告的數據有一定的差異。如Bertina等人報告荷蘭門診血栓病人遺傳性APC-R的發生率約為20％左右^[2]；在南瑞典卻為28％^[8]，那裡是FⅤ突變的高發區；Ridker等人的一項對健康男性長達8.6年的調查中發現，發生血栓病的組別中，FⅤ：Q⁵⁰⁶的發生率只有11.6％^[9]。但總的來看，由于FⅤ突變所引發的APC-R的確是血栓發生的重要高危因素，現已公認由FⅤ突變引發的遺傳性APC-R是目前所見的靜脈血栓形成最常見的遺傳誘因，其雜合子患者血栓發生率較其它人高6～8倍，而純合子的發生率則高30～140倍^[2]。

　　遺傳性APC-R的臨床表現與其它抗凝因子（PC、PS、AT）的缺乏相似，深靜脈血栓（DVT）是最常見的，而肺栓塞較少見。其臨床血栓發病率的個體差異較大，有些人可能終身不發生血栓，而有些人則從小反復發生嚴重的血栓，純合子發病機率高于雜合子；發生血栓的危險性終生存在，並隨年齡的增長而增加，但有25％的患者在50歲以前發生血栓。此外，遺傳性APC-R個體發生血栓也與環境因素有關，包括口服避孕藥、創傷、外科手術及妊娠，甚至有報道長時間旅行靜坐也可能誘發APC-R個體發生血栓。在一項對50個APC-R家族的研究中發現，首次發生血栓並與環境誘因相關的佔病人的63％^[10]。婦女口服避孕藥及妊娠是誘發血栓形成的高危因素，因為在口服避孕藥或妊娠期間發生血栓或血栓並發症的婦女中，分別發現有30％和47％～60％的病人有APC-R；遺傳性APC-R與流產的關系近來有所報道並認為APC-R是導致流產的一個重要因素，但現有的報道仍有矛盾之處：Dizord等研究的一組復發流產婦女中盡管有APC-R，但卻無FⅤ突變^[11]；而Brenner等的病例資料中卻發現FⅤ突變率很高^[12]。APC-R可能是術後血栓形成的主要病理因素之一，有報道膝關節成形術後發生DVT的病人中有30％發現有APC-R。遺傳性APC-R若再合並有其它抗凝因子的缺陷（如PC），則發生血栓的機率將顯著增加^[19]。

　　遺傳性APC-R與動脈血栓發生的關系似乎不大，有報道FⅤ：Q⁵⁰⁶純合子的年輕患者有心肌梗塞發生，但這方面的研究還需進一步深入以闡明二者的關系^[13]。

　　4 獲得性APC-R

　　在家族研究中發現，有些APC-R家族患者並無FⅤ突變，提示APC-R的遺傳學基礎不一定僅為FⅤ突變，亦有獲得性APC-R的可能。國內王鴻利等人報道的一組數據顯示，中國DVT患者的APC-R陽性率明顯高于正常人，但卻未發現有FⅤ突變。有研究提示，中風患者APC比率明顯低于正常人而並無FⅤ突變^[13]；Visser等最新的研究表明，非FⅤ突變所致APC-R也是靜脈血栓發生的高危因素。狼瘡性抗凝物質（LA）由于可幹擾PC系統反應而被認為可能導致獲得性APC-R^[14]。Ehrenforth等人報告在300例易栓症患者中45（15％）例發現有APC-R，其中17例（37.7％）LA陽性獲得性APC-R也發現于急性血栓形成患者，這可能與急性時相反應中促凝因子如FⅤ和纖維蛋白升高以及具有APC抑制性的α_1-抗胰蛋白酶升高有關^[7]。妊娠中由于生理性適應而使促凝系統效率增高、PC系統受到抑制，APC反應低于未妊娠婦女，若合並其它病理性抗凝物質，也有可能發生獲得性APC-R。這方面的研究尚待深入。

　　參考文獻

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　　(1998-11-22收稿 1990-02-05修回)

　　錄入：姬穎

　　校對：惠冬莉