動脈成形術對血管表皮生長因子受體表達影響的免疫組化研究

　　第二軍醫大學學報1999年第20卷第4期

　　王兵　李玉莉　何金　張國元　芮耀誠　吳宗貴

　　摘　要　目的：觀察動脈成形術對血管平滑肌細胞（SMC）表皮生長因子受體（EGFR）表達的影響，探討EGFR與再狹窄的關系。方法：于兔右頸總動脈成形術前及術後24，48，72h，7d和14d，取實驗動脈段用免疫組化LSAB法檢測EGFR的表達。結果：正常頸總動脈中膜未見EGFR陽性表達；動脈成形術後24h，中膜部分SMC顯示EGFR陽性表達；48和72h中膜EGFR陽性表達均進一步增加；7和14d動脈中膜EGFR陽性表達的SMC均較72h顯著減少，但新生內膜中增殖的SMC均顯示大量EGFR陽性表達。陽性染色以胞膜處最明顯。結論：動脈成形術使血管SMC EGFR表達顯著增加，再狹窄形成過程中SMC增殖與EGFR有關。

　　關鍵詞：動脈成形術　血管平滑肌細胞　表皮生長因子受體　免疫組織化學

　　經皮冠狀動脈腔內成形術（PTCA）後6個月內再狹窄的發生率高達30%～50%^﹝1﹞，成為其應用的主要障礙。研究表明，再狹窄的主要病理機制是動脈中膜平滑肌細胞（SMC）對損傷的過度修復，表現為中膜SMC被激活，由收縮表型轉化為合成表型，進而遷移至內膜下增殖並分泌細胞外基質^﹝2,3﹞。SMC激活是多種因素綜合作用的結果，其中一些生長因子可能起主要作用，而生長因子又必須通過其相應受體介導發揮作用。本研究用免疫組化技術，觀察動脈成形術對SMC表皮生長因子受體（EGFR）表達的影響，擬探討EGFR與再狹窄的相關性。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要試劑　標記抗體SMActin和Desmin，Dako公司產品；兔抗鼠EGFR抗血清，中國科學院上海細胞生物學研究所徐永華教授惠贈；LSAB組化試劑盒，Dako公司產品。

　　1.2　動物及分組　取純種新西蘭雄性兔（第二軍醫大學實驗動物中心提供）36只，體質量2.5～3.0kg，隨機分為未損傷正常動脈組，損傷24，48，72h組、7及14d組，每組6只。

　　1.3　頸總動脈球囊內膜剝脫術　按文獻﹝4﹞方法進行。

　　1.4　血管SMC的鑑定　各組隨機取3個血管，常規10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片，每個血管隨機取1張切片，用免疫組化LSAB法以標記抗體SMActin和Desmin行血管SMC鑑定。

　　1.5　EGFR表達的免疫組化染色　各組每個動脈隨機取不連續切片3張，用LSAB法行免疫組化染色。切片脫蠟；置0.3%H₂O₂的甲醛液中20min，去除內源性過氧化物酶；PBS洗後滴加正常豬血清(1︰10)，室溫孵育30min；滴加兔抗鼠EGFR抗血清(1︰80)，4℃過夜，PBS洗；生物素標記的豬抗兔(1︰400)孵育30min，PBS洗；過氧化酶標記的鏈卵白素(Streptavidin 1︰400)30min，PBS洗；DAB-H₂O₂溶液顯示後，蘇木精復染，脫水，封片，光鏡觀察。陰性對照用PBS代替一抗。

　　2　結　果

　　2.1　血管SMC的鑑定　各組血管中膜排列整齊的梭形細胞及損傷7和14d組新生內膜中雜亂排列的胖梭形細胞，SMActin和Desmin免疫組化染色均呈棕黃色的陽性結果，提示均為SMC。

　　2.2　EGFR表達的免疫組化染色　正常頸總動脈中膜免疫組化未顯示出棕黃色的陽性染色（圖1）；動脈成形術後24h中膜部分SMC顯示出棕黃色的陽性顆粒（圖2），術後48h中膜呈棕黃色陽性染色的SMC較24h增加，72h又較48h進一步增加（圖3）。在動脈成形術後72h內，中膜EGFR表達顯著增加。動脈成形術後7及14d（圖4）中膜呈棕黃色陽性染色的SMC數量相似，均較72h顯著減少，但兩組增厚的新生內膜中雜亂排列的增殖SMC均顯示出大量的棕黃色陽性染色。陽性染色以胞膜處表達最明顯。(圖見封三)

圖1　正常頸總動脈中膜EGFR表達

　　Fig 1　Immunohistochemical staining for EGFR expression in normal rabbit common carotid artery (LSAB method ×200)

2　頸總動脈成形術後24h中膜EGFR表達

　　Fig 2　Immunohistochemical staining for EGFR expression in rabbit common carotid artery 24h after angioplasty (LSAB method×200)

圖3　頸總動脈成形術後72h中膜EGFR表達

　　Fig 3　Immunohistochemical staining for EGFR expression in rabbit common carotid artery 72h after angioplasty (LSAB method×200)

4　頸總動脈成形術後14d新生內膜EGFR表達

　　Fig 4　Immunohistochemical staining for EGFR expression in rabbit common carotid arterial neointima 14d after angioplasty (LSAB method×200)

　　3　討　論

　　動脈成形術後再狹窄的發生機制尚未完全闡明，臨床至今仍無有效預防措施，嚴重影響著PTCA的遠期療效。臨床病理檢查和動物實驗均證實再狹窄斑塊主要為增殖的SMC^﹝5，6﹞。業已證實，在動脈粥樣硬化的形成和動脈內膜損傷後修復的過程中，EGF、血小板衍生生長因子（PDGF）、酸性或堿性成纖維細胞生長因子（aFGF or bFGF）、胰島素樣生長因子1 （IGF-Ⅰ）、IGF-Ⅱ、轉化生長因子β（TGFβ）、白細胞介素1 （1L-1）和1L-6等生長因子和細胞因子促進了動脈SMC的增殖^﹝7﹞。

　　EGFR是廣泛存在于哺乳類動物細胞表面的膜受體，是一種相對分子質量為1.7×10⁵的跨膜糖蛋白，由N端的胞外區、跨膜區和C端胞內區3部分組成，它通過胞外區的配體結合結構域可以和EGF或轉化生長因子α（TGFα）特異性結合，傳遞生長因子的信號，影響細胞的生長或分化^﹝8﹞。EGFR的蛋白激酶結構域和癌基因V-erbB1高度同源，人EGFR基因定位在第7號染色體上，若將病毒的啟動子或激活子插入細胞基因，可將EGFR基因變成癌基因。EGFR膜內部分有一個由250個氨基酸殘基組成的片段，該片段與癌基因sac族酪氨酸蛋白激酶的結構相似，推測EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，可能在特殊情況下不需與配體結合就處于激活狀態，從而使細胞內蛋白質的酪氨酸基磷酸化，產生細胞分裂信號^﹝9﹞。

　　研究表明，離體培養的增殖期SMC能高水平地表達EGFR，而靜止期SMC的EGFR表達水平較低^﹝7﹞。本研究進一步證實了正常動脈SMC EGFR表達水平較低，在動脈成形術後72h內，中膜EGFR表達顯著增加，7和14d中膜EGFR表達顯著減少，但新生內膜中大量增殖的SMC均高水平地表達EGFR，EGFR主要定位于SMC的胞膜。本研究用EGFR抗血清和免疫組化方法顯示除了胞膜表達外，胞質表達也是常見的現象。有關胞質內受體的來源尚不明確，據分析這種胞質內受體可能代表內化的受體、新合成尚需進一步加工和插入胞膜的受體或僅由受體胞質區組成的截斷性受體。在EGF不存在時，EGFR隨機分布在質膜上，當EGF存在時，受體迅速集聚在被膜小凹內，並內化進入細胞內形成受體顆粒（receptorsomes），然後出現在與高爾基體相關的被膜結構內，最後在溶酶體內降解，EGFR也隨之下調。內化的受體少部分在溶酶體內降解，絕大部分重新循環到細胞表面。血管成形術後，SMC類似腫瘤細胞能擺脫機體正常調控而自主性生長及高水平地表達EGFR，EGFR基因擴增、重排或轉錄控制異常可能是重要原因之一^﹝9﹞。動脈成形術後，增殖期SMC高水平表達的EGFR可以成為抑制其增殖的攻擊目標，本研究為再狹窄機制的探討及藥物預防研究提供了實驗依據。

　　國家自然科學基金資助項目，批準號39670316

　　作者單位：王兵　張國元　吳宗貴　第二軍醫大學長征醫院心血管內科，上海，200003

　　李玉莉　何金　第二軍醫大學長征醫院病理科

　　芮耀誠　第二軍醫大學藥學院藥理學教研室

　　作者簡介：王兵，男，1966年2月生，博士主治醫師，現在第二軍醫大學長征醫院腫瘤科

　　參 考 文 獻

　　[1]　Rozenman Y,Gilon D,Welber S,et al.Total coronary artery occlusion late after successful coronary angioplasty of moderately severe lesions:incidence and clinical manifestation.Cardiology,1994,85(3/4):222

　　[2]　Riessen R,Isner JM.Prospects for site-specific delivery of pharmacologic and molecular therapies.J Am Coll Cardiol,1994,23(5):1234

　　[3]　Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s.Nature,1993,362(6423):801

　　[4]　王兵，李玉莉，關戰軍，等.TGF_α-PE40對兔頸總動脈損傷後內膜增生的抑制作用.第二軍醫大學學報，1998，19(2)：165

　　[5]　Miano JM,Vlasic N,Tota RR,et al.Smooth muscle cell immediate-early gene and growth factor activation follows vascular injury.A putative in vivo mechanism for autocrine growth.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1993，13(2):211

　　[6]　Morimoto S,Mizuno Y,Hiramitsu S,et al.Restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty----a histopathological study using autopsied hearts.Jpn Circ J,1990,54(1):43

　　[7]　Epstein SE,Siegall CB,Biro S,et al.Cytotoxic effects of a recombinant chimeric toxin on rapidly proliferating vascular smooth muscle cells.Circulation,1991,84(2):778

　　[8]　Epstein SE,Speir E,Unger EF,et al.The basis of molecular strategies for treating coronary restenosis after angioplasty.J Am Coll Cardiol,1994,23(6):1278

　　[9]　徐永華.細胞生長因子和受體.生命的化學，992,12（4）：4