骨調素與腎髒疾病

　　中華腎髒病雜志 CHINESE JOURNAL OF NEPHROLOGY

　　1999年第15卷第1期 Vol.15 No.1 1999

陳永雄　李龍　尹培達　餘學清

　　關鍵詞：骨調素(OPN) 腎髒疾病

　　骨調素(Osteopontin,OPN)是一類含Arg-Gly-Asp (RGD，精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)三肽序列的高度酸性的磷酸化分泌性糖蛋白，最初由骨組織中分離所得，屬非膠原的骨基質蛋白^〔1〕。OPN不僅是細胞外基質，也是淋巴細胞因子和巨噬細胞趨化和粘附分子，具有促進B淋巴細胞多克隆激活，調節骨的形成，促進巨噬細胞粘附和聚集，促進平滑細胞遷移和腫瘤細胞轉移等多種生理功能^〔1-3〕。近年來研究表明，OPN在腎髒疾病，尤其在腎小管間質損傷和纖維化中起著重要作用^{〔1，4，5〕}，我們就OPN與腎髒疾病發生發展的關系做一簡要綜述。

　　一、OPN的結構

　　迄今為止，人們已克隆出小鼠、大鼠、豬、牛、雞和人的OPN cDNA和基因^〔6〕，通過比較分析，發現這些種屬OPN基因的核苷酸有中等水平的序列保守性，其中氨基端、羧基端和編碼含RGD三肽序列的50個氨基酸區有高度的序列保守性。OPN基因含有6個外顯子和5個內含子，它的啟動子含有一個特征性的TATA盒(-28-22)，一個反向的CCAAT盒(-55-50)和一個GC盒(-100-93)。人、大鼠和小鼠的OPN基因分別編碼314，327和297個氨基酸，人和大鼠的OPN氨基酸序列有65%的同源性，而大鼠和小鼠的OPN氨基酸序列有86%的同源性。盡管OPN是單基因產物，但由于RNA的拼接和翻譯後磷酸化、糖基化及蛋白水解程度的不同而以多種形式存在^〔1，3〕。OPN的2級結構有8個α螺旋和6個β片狀部分；有RGD結構區，是依賴αV整合素的細胞粘附和遷移所必需的位點；有1個鈣結含位點；有2個肝素結合位點，1個與RGD結構區毗鄰，另1個靠近OPN的羧基端；有3個凝血酶裂解位點，1個是RGD三肽中的Arg-Gly位點，另兩個是在氨基酸序列中的153-154和157-158位點，其中157-158位點是凝血酶主要的裂解位點；OPN也有與骨基質的羥磷灰石結合的富含精氨酸的結構區^〔2，6〕。

　　二、OPN的分布和調節

　　OPN最初發現于成骨細胞和破骨細胞^〔1〕，以後發現巨噬細胞、T淋巴細胞、腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、平滑肌細胞、各種上皮細胞和一些腫瘤細胞均能產生OPN^{〔1，3，7，8〕}。對正常鼠進行原位雜交及免疫組化染色分析，發現腎組織的髓袢升支厚段和遠曲小管、集合管及腎小球囊壁層上皮細胞有少量OPN表達，而腎小球、近曲小管、髓袢薄段及間質成纖維細胞則無OPN的表達^〔1，9〕。Nagasaki等人報道體外培養的大鼠腎小球系膜細胞有OPN基因及蛋白的表達^〔8〕。此外，人的正常組織如肝、膽、胰、胃腸道、子宮、尿道、乳腺、唾液腺、汗腺及肺支氣管均有OPN的表達^〔6〕。

　　OPN的表達受激素、生長因子、細胞因子及癌基因等多種因素的調節^〔6，8〕。研究表明，1，25-二羥維生素D₃正向調節OPN的表達，甲狀旁腺素則負向調節OPN的表達，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、上皮生長因子(EGF)、轉化生化因子β(TGFβ)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNFα)、白介素1α(IL-Iα)促進OPN的表達，其它如刀豆蛋白A(ConA)、組織纖溶酶原激活物(TPA)、激活的ras基因也促進OPN的表達。

　　三、OPN與腎髒疾病

　　巨噬細胞浸潤是多種類型實驗性動物腎炎模型和人類腎小球腎炎的共同特征，促使巨噬細胞聚集到腎髒並與腎髒固有細胞相互作用的機理一直倍受人們重視，人們從多種腎小球腎炎和間質性腎炎的動物模型的研究中發現，巨噬細胞浸潤均發生在有組織損傷並過度表達OPN的腎小球或腎小管區域^{〔1，3～5〕}，提示OPN是介導巨噬細胞在腎組織浸潤並導致損傷的關鍵因子。一些研究也發現，OPN與腎結石和腎腫瘤的發生有密切關系^{〔2，3，10，12，13﹞}。

　　1.OPN與間質性腎炎：Giachelli等人最早用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘發的間質性腎炎模型揭示在腎小管間質損傷區域的腎小管中有OPN的過度表達^〔1〕。在給大鼠皮下微泵持續輸注AngⅡ第7～14天，發生腎小管間質損傷的區域腎小管上皮細胞有OPN mRNA和蛋白的過度表達，且高表達OPN的部位有大量巨噬細胞的浸潤，無OPN表達的部位則無或僅有少量巨噬細胞浸潤。隨後Young等人在環孢素A(CsA)誘發的間質性腎炎模型中也觀察到，發生間質纖維化的區域，腎小管上皮細胞有OPN的過度表達，且與巨噬浸潤、聚集的部位相一致^〔1〕。Sakai等人也在單側輸尿管結扎誘發的間質性腎炎模型中證實，腎小管上皮細胞OPN的表達與腎小管間質巨噬細胞的浸潤密切相關^〔11〕。提示腎小管上皮細胞分泌的OPN可促使巨噬細胞在相應腎小管週圍聚集，表明OPN在巨噬細胞浸潤並介導腎小管間質損傷和纖維化中發揮重要的致病作用。

　　2.OPN與腎小球腎炎：既往已證實在多種腎小球腎炎模型，如系膜增生性腎炎(Thy l model)，局灶性節段性腎小球硬化(aminonucleoside or PAN nephrosis)和膜性腎病(passive Heymann nephritis)等，腎小管間質損傷區域的腎小管上皮細胞過度表達OPN，且與巨噬細胞的浸潤密切相關^〔1，3〕。許多研究發現，這幾種腎小球腎炎模型的腎小管間質損傷均發生在模型誘發後的第5～14天，而腎小管OPN mRNA的表達在第3～7天即顯著上調，隨後出現的OPN蛋白表達早于巨噬細胞的腎髒浸潤，隨著病情的發展，整個皮質區的腎小管均有OPN的高度表達，並伴有廣泛的腎小管損傷和巨噬細胞浸潤。提示腎小管OPN表達與腎小管間質損傷和巨噬細胞浸潤有密切的關系。最近，Lan等人用實驗性新月體腎炎(accelerated anti-GBM)模型進一步研究了OPN的表達在腎小球損傷中的作用^〔3〕，他們發現，在新月體腎炎模型中，OPN除導致巨噬細胞當浸潤和腎小管間質損傷外，在促進T淋巴細胞浸潤，腎小球新月體形成及多核巨細胞形成中也起著重要作用。

　　3.OPN與腎結石：許多研究提出結石基質與結石的發生及增長有密切關系，但它的化學成分不完全清楚。OPN cDNA序列可編碼草酸鈣結石蛋白，提示OPN可能作為結石基質的一個成分參于結石的形成，酸性氨基酸如天門冬氨酸和谷氨酸是結石基質中兩種主要氨基酸，OPN出現在草酸鈣和磷酸鈣結石中，而不出現在尿酸鈣結石中。Yamate等人^〔12〕觀察到結石形成過程中，鼠腎遠曲小管OPN表達增加。OPN由于含有佔整個序列40%的天門冬氨酸，因而可參與結石形成。OPN也可通過Arg-Gly-Asp序列發揮其細胞粘附作用，通過與細胞表面受體結合，促使腎遠曲小管上皮細胞與草酸鈣晶體粘附，因而OPN在含鈣的尿路結石中有重要作用。然而也有研究認為，分泌到小管液中的OPN可通過破壞結晶過程抑制草酸鈣晶體的生成，從而抑制腎結石的形成^〔13〕。因此，OPN在腎結石中形成中的確切作用還有待于進一步的研究。

　　4.OPN與腎腫瘤：已有研究證實，OPN與腫瘤細胞的增生和轉移關系密切。Brown等^〔10〕報道14例腎細胞癌中，13例有OPN mRNA表達。免疫組化檢查可見腎細胞及巨噬細胞胞漿中有彌漫性OPN蛋白染色。大多數腫瘤患者，OPN常定位于腫瘤細胞附近的巨噬細胞中，而腫瘤細胞本身未見OPN mRNA表達，推測可能由于腫瘤細胞合成OPN mRNA水平低，用原位雜交方法不能測出。OPN導致腫瘤發展的機制，目前認為可能是由于OPN的粘附作用，促進癌細胞粘附並穿透基底膜屏障，與細胞外基質相連。其次，OPN通過細胞表達的αvβ₃整合素與腫瘤細胞結合，從而激活細胞傳導途徑，促進腫瘤的發展。此外，OPN可抑制NO合成，從而增加轉移癌細胞的生存率。

　　5.OPN與腎移植：有關OPN在人類腎髒疾病中表達的文獻甚少。在持續應用CsA的腎移植受者中，皮質區腎小管有彌漫性的OPN表達，伴有中等程度但廣泛的巨噬細胞浸潤；然而，發生以淋巴細胞浸潤為主的細胞排斥反應的移植腎，發生排斥部位的腎小管OPN表達減少，這是否由于腎小管壞死而失去OPN的表達，還是由于浸潤的淋巴細胞分泌抑制性細胞因子而抑制OPN的表達，目前尚不清楚^〔1〕。

　　四、抗OPN治療對實驗性新月體腎炎的影響

　　上述研究已經表明，在多種類型的腎炎模型發病過程中，腎髒組織中OPN的水平顯著上調，並與巨噬細胞的局部浸潤、腎髒病理改變及腎功能損害密切相關。為了進一步證實OPN在實驗性腎小球腎炎發病機理中的作用，餘學清等應用抗OPN抗體治療實驗性新月體腎炎模型大鼠^〔14〕，觀察其對實驗性新月體腎炎誘導期及已確立的新月體腎炎的影響，結果顯示，抗OPN治療可顯著抑制OPN mRNA和蛋白的表達，減少巨噬細胞浸潤，減輕蛋白尿和保護腎功能，在已確立的新月體腎炎，抗OPN治療同樣可顯著抑制OPN mRNA及蛋白的表達，抑制巨噬細胞的局部聚集，減輕腎髒病變和部分逆轉腎功能，揭示抗OPN抗體對于新月體腎炎有潛在的治療價值，同時也進一步證實OPN的確在介導巨噬細胞浸潤導致的腎小球腎炎和間質性腎炎的發病機理中起著關鍵作用。這為腎髒疾病的抗OPN治療提供了理論依據。目前，國內外還尚未開展應用OPN反義核酸治療腎小球腎炎和間質性腎炎的研究，然而，國外在應用OPN反義核酸抑制血管平滑肌OPN表達方面的研究已取得成效^〔15〕，這為腎髒疾病的抗OPN治療提供了新的思路和方法。

　　綜上所述，OPN是導致腎髒疾病中巨噬細胞浸潤和腎小球、腎小管間質損傷的關鍵細胞因子，抗OPN治療能阻止或減輕腎小球和腎小管間質損傷和纖維化的發生和發展，促進腎功能的恢復。我們目前正在應用表達OPN反義核酸的逆轉錄病毒和腺病毒重組體進行抑制培養的腎小管上皮細胞和系膜細胞OPN表達和治療間質性腎炎模型的實驗研究。

　　作者單位：510080 廣州，中山醫科大學附屬第一醫院腎內科

　　參考文獻

　　1　Pichler R, Giachelli CM, Young B, et al. The pathogenesis of tubulointerstitial disease associated with glomerulonephritis: the glomerular cytokine. Miner Electrolyte Metab, 1995，21：317-327.

　　2　Dede T, Katagiri Y, Lizuka J, et al. Osteopontin, a coordinator of host defense system: a cytokine or an extracellular adhesine protein? Microbiol Immunol, 1997，41：641-648.

　　3　Lan HY, Yu XQ, Yang NS, et al. De novo glomerular osteopontin expression in rat crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 1998，53：136-145.

　　4　Gouser WG, Johnson RJ. Mechanisms of progressive renal disease in glomeralonephritis. Am J Kidney Dis,1994，23：193-196.

　　5　Pichler R, Giachelli CM, Lombardi D, et al. Tubulointerstitial disease in glomerulonephritis. potential role of osteopontin (uropontin). Am J Pathol,1994，144：915-926.

　　6　Denhardt DT, Guo X. Osteopontin: a protein with diverse functions. FASEB J, 1993，72:1475-1482.

　　7　Malyankar UM, Almeida M, Johnson RJ, et al. Osteopontin regulation in cultured rat renal epithelial cells. Kidney Int,1997，51：1766-1773.

　　8　Nagasaki T, Ischimura E, Shioi A, et al. Osteopontin gene expression and protein synthesis in cultured rat messangial cells. Biochem Biophys Res Commun,1997，233：81-85.

　　9　Lopez CA, Hoyer JR, Wilson PD, et al. Heterogenetity of osteopontin expression among nephrons in mouse kidneys and enhanced expression in sclerotic glomeruli. Lab Invest, 1993，69：355-363.

　　10 Brown LF, Sergioll AP, Serse B, et al. Osteopontin expression and distribution in human cancinomas. Am. J Pathol,1994，145：610-623.

　　11 Sakai T, Tanaka H, Shirasawa. Two distinct epithelial responses may compensate for the ureteral obstruction in early and late phase of unilateral ureteral obstructiontreated

　　rat: cellular proliferation in acute phase and osteopontin expression in chronic phase. Nephron,1997，77：340-345.

　　12 Yamate T, Kohri K, Umekawa T, et al. The effect of osteopontin on the adhesion of calcium oxalate crystals to madin-Dar by caine kidney cells. Eur Urol,1996，30：388-393.

　　13 Siraga H, Min W, Vandusen WJ, et al. Inhibition of calcium oxalate crystal growth in vitro by uropontin: another member of the aspartic acid-rich protein superfamily. Proc Natl Acad Sci USA, 1992，89：426-430.

　　14 Yu XQ, Nikolic-Paterson DJ, Mu W, et al. A functional role for osteopontin in experimental crescentic glomerulonephritis in the rat. Proceedings of the Association of American Physicians. 1998，110:50-61.

　　15 Weintraub AS, Giachelli CM, Krauss RS, et al. Autocrine secretion of osteopontin by vascular smooth muscle cells regulates their adhesion to collagen gels. Am J Pathol,1996，149：259-272.

(收稿：1998-08-15)

(本文編輯：孫玉玲)