小劑量阿斯匹林在顯微血管外科應用中的研究

　　中國修復重建外科雜志2000年第14卷第3期

安智全　顧玉東　鐘高仁　朱建華　徐明光　許小風　高福琴

　　摘　要　目的　研究小劑量阿斯匹林對小動脈吻合口血小板沉積及對凝血系統功能的影響，為臨床用藥提供實驗依據。方法　SD大鼠28只，實驗組(21只)阿斯匹林4 mg/kg，經股靜脈插管注射，對照組(7只)用等體積生理鹽水。實驗組動物按給藥後存活24、48和72小時再分組，每組7只。給藥後，在上述時間間隔，經心髒穿刺採血，測血小板最大聚集率(MAR)、凝血酶原時間(PT)和白陶土部分凝血活酶時間(KPTT)。新西蘭白兔16只，分實驗組和對照組各8只，實驗組耳緣靜脈注射阿斯匹林(4 mg/kg)，對照組用等體積生理鹽水。48小時後，股動脈腹股溝韌帶至腹壁淺動脈段切斷，端端吻合。恢復血流後15和120分鐘，分別切取通暢的左、右側吻合口段股動脈，用¹²⁵Ⅰ-SZ-21(抗GPⅡa/Ⅲa單克隆抗體)放射免疫結合分析法處理，測吻合口放射活性。結果　阿斯匹林靜脈注射後24和48小時，KPTT較對照組平均分別延長42.56%和35.33%，其中，用藥後24小時組差異非常顯著(P＜0.001)。用藥後72小時內，實驗組PT值均較對照組延長，但差異無顯著意義(P＞0.05)。用藥後72小時內，MAR均明顯低于對照組，差異非常顯著(P＜0.001)。術後15分鐘，實驗組吻合口抗血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅱa抗體的放射活性明顯高于對照組，平均增加110%，差異非常顯著(P＜0.001)。結論　小劑量阿斯匹林靜脈用藥，可明顯抑制內源性凝血系統的功能，抑制血小板聚集，但對外源性凝血系統的功能無影響。能使術後早期的動脈吻合口血小板沉積明顯增加，但這種增加不足以引起吻合口血栓形成。小劑量阿斯匹林對全身和對吻合口局部的作用不一致。

　　關鍵詞：阿斯匹林　小劑量　股動脈　端端吻合

　　阿斯匹林是一種抗血小板藥物，在遊離組織移植或斷肢再植中廣泛應用。其作用機制在于使血小板環氧化酶乙酰化，血栓烷A₂(thromboxane a₂,TXA₂)生成減少，抑制血小板聚集，防止血栓生成^﹝1﹞。大劑量的阿斯匹林可同時抑制血管內皮細胞的環氧化酶，使擴血管的前列腺素I₂(prostaglantin i₂,PGI₂)生成減少，血小板聚集增加，血栓生成。Wieslander等^﹝2～6﹞用多種動脈血栓生成動物模型研究了小劑量阿斯匹林的作用，結果不盡一致，特別是對吻合口血小板沉積的影響研究更少見。為此，我們通過動物實驗，對這一問題進行探討。

　　1　材料與方法

　　1.1　阿斯匹林對凝血系統功能的影響

　　健康SD大鼠28只，體重320～370 g，1%戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，股靜脈插管，實驗組(21只)阿斯匹林賴氨酸鹽(安徽蚌埠醫藥研究所實驗廠提供，每克含乙酰水楊酸0.5 g)按7.2 mg/kg(相當于阿斯匹林4 mg/kg，臨用前用生理鹽水配制，濃度1.8 mg/ml)股靜脈注射，對照組(7只)用等體積生理鹽水。實驗組動物按給藥後24、48和72小時再分成三組，每組7只，給藥後經心髒穿刺採血3 ml，枸櫞酸鈉抗凝(v/v,6︰1)，以腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)(Sigma公司提供，工作濃度5 μmol/L，用0.01 mol/L PBS pH7.4配制)為激活劑、TYXN-智能血液凝集儀(上海通用機電技術研究所生產)測血小板最大聚集率(maximal aggregation rate of platelet,MAR)，用ACL3000-自動凝血分析儀(美國庫爾特公司生產)及配套試劑盒測凝血活酶時間(prothrombin time,PT)和白陶土部分凝血活酶時間(kaolin partial thromboplastin time,KPTT)。

　　1.2　阿斯匹林對吻合口血小板沉積的影響

　　1.2.1　抗血小板抗體的標記　單克隆抗體SZ-21(抗GPⅡb/Ⅲa抗體，由蘇州醫學院血栓研究室提供)用氯胺-T法同位素¹²⁵Ⅰ標記(Na¹²⁵Ⅰ液由中國原子能研究院提供)。

　　1.2.2　標本制備及測定　新西蘭白兔16只，體重2.2～2.5 kg，分實驗組和對照組，各8只，實驗組經耳緣靜脈注射阿斯匹林賴氨酸鹽(7.2 mg/kg)，對照組用等體積生理鹽水。48小時後，耳緣靜脈注射1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，暴露股動脈腹股溝韌帶至下腹壁淺動脈分支段，切斷後端端吻合，共10針。恢復動脈血流後15和120分鐘，勒血實驗證實吻合口通暢後，分別阻斷左、右吻合口近端血流，取包括吻合口在內共約6 mm長股動脈段，4%多聚甲醛固定，內膜面朝上展開並固定于透明膠帶上，用抗GPⅡb/Ⅲa抗體的放射免疫結合分析法處理。方法：標本用PBS(0.01 mol/L pH7.4，下同)洗三遍，每次10分鐘，入0.3%牛血清白蛋白(用PBS配制)，37℃孵育30分鐘，加入¹²⁵Ⅰ-SZ-21單抗溶液300μl(2.6×10⁴cpm)，4℃孵育72小時，PBS洗，FJ-2008放射免疫計數儀測放射活性。以正常血管組織作為本底。

　　1.3　統計學處理

　　所有實驗數據均採用t檢驗法處理。

　　2　結果

　　2.1　阿斯匹林對PT和KPTT值的影響

　　阿斯匹林靜脈注射後對大鼠PT和KPTT的影響見表1。給藥後24和48小時，KPTT較對照組分別延長42.56%和35.33%，給藥後72小時，兩組基本相同，其中，給藥後24小時兩者有非常顯著性差異(P＜0.001)。用藥後72小時內，實驗組PT值均較對照組延長，但各組差異均無顯著性意義(P＞0.05)。

　　2.2　小劑量阿斯匹林對血小板聚集功能的影響

　　濃度5 μmol/L的ADP引起正常大鼠血小板50%的最大聚集率的溶液體積為15μl。阿斯匹林靜脈注射後24、48和72小時對大鼠MAR的影響見表1。給藥後各時間組，MAR分別減低49.60%、41.10%和32.55%，差異均非常顯著(P＜0.001)。

表1　小劑量阿斯匹林對大鼠PT、KPTT和血小板MAR值的影響(X±s)

Tab.1　The effects of low dose aspirin on the pT、KPTT and platelet MAR platelet in the rat (X±s)

　　2.3　小劑量阿斯匹林對小動脈吻合口血小板沉積的影響　　用氯胺-T法標記SZ-21的標記率大于85%，放射性得率大于65%，放射化學純度經紙層層析法、醋酸纖維薄膜電泳和高效液相色譜法測定均大于95%。紙層分析法標記抗體R_f0.8-1.0，遊離碘R_f0.8-1.0。術後15和120分鐘吻合口均通暢。

　　阿斯匹林注射後48小時，對術後15和120分鐘吻合口血小板沉積的作用見表2。術後15分鐘，實驗組吻合口¹²⁵I標記抗血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅱa抗體(SZ-21)的放射活性較對照組增加109.78%，有非常顯著性差異(P＜0.001)。術後120分鐘實驗組吻合口放射活性稍高于對照組(4.06%)，無顯著性差異(P＞0.05)。

表2　小劑量阿斯匹林對家兔股動脈吻合口血小板沉積的影響(n=8,X±s)

Tab.2　The effects of low dose aspirin on the deposition of the platelets at the anastomotic sites in the rabbit femoral arteries(n=8,X±s)

　　3　討論3.1　小劑量阿斯匹林對凝血系統功能的影響

　　阿斯匹林作用的機制是抑制PGs合成的限速酶----環氧酶的活性，降低TXA₂的生成，抑制血小板聚積^﹝7﹞。

　　May等^﹝8﹞對健康志願者的研究發現，小劑量阿斯匹林可抑制膠原、瑞斯託霉素、花生四烯酸以及膠原、鏈激酶、ADP、腎上腺素和血小板激活因子(platelet activating factor,PAF)的各種聯合所引起的血小板聚集，用藥2天後的作用相同，但也發現ADP誘導血小板聚集的作用不明顯。Feng等^﹝9﹞證明小劑量阿斯匹林不僅可抑制膠原和腎上腺素誘導的血小板聚集，也可抑制ADP誘導的血小板聚集，ADP在常規的30μmol/L濃度時，不出現雙相的血小板聚集。May等的ADP濃度為10μmol/L。我們的結果證實，常規的1.0 μmol/L濃度ADP不能誘導血小板出現50%的聚集率，而5μmol/L ADP濃度則能達到50%的血小板聚集率的ADP量為15 μl。我們的研究發現小劑量阿斯匹林靜脈注射72小時內均能顯著抑制ADP誘導的血小板聚集。

　　我們的研究結果同時也表明，阿斯匹林靜脈用藥後24小時，KPTT值較對照組明顯延長，而用藥後72小時內PT值和對照組相比未見顯著改變，表明小劑量阿斯匹林靜脈用藥，對內源性凝血系統有更明顯的抑制作用。

　　3.2　小劑量阿斯匹林對小動脈吻合口血小板沉積的影響

　　血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa是一種纖維蛋白原受體，參與血小板的激活過程，正常人每個血小板表面GPⅡb/Ⅲa分子數為(5.45±1.19)×10⁴，我們以¹²⁵Ⅰ標記抗GPⅡb/Ⅱa抗體SZ-21與吻合口沉積血小板特異性結合的放射免疫結合方法，證明小劑量阿斯匹林靜脈注射後48小時，可使家兔股動脈端端吻合術後15分鐘的吻合口SZ-21放射活性較對照組增加110%，差異非常顯著，術後120分鐘，實驗組和對照組無明顯區別。Salemark等^﹝3﹞將體外標記血小板靜脈注射後，在家兔耳中央動脈端端吻合和動脈內膜切除模型中證實，術中小劑量阿斯匹林動脈灌注不能降低標記血小板在吻合口的沉積，但術前10小時用藥可降低吻合口血小板放射活性。Basile等^﹝5﹞用家兔股動脈外膜內翻移植模型發現，小劑量阿斯匹林經灌胃給藥，術前3天和術後7天連續用藥，不能增加吻合口通暢率。Peter等^﹝6﹞認為，小劑量阿斯匹林術中動脈灌注可提高大鼠股動脈外膜內翻吻合的血管通暢率。我們的研究中阿斯匹林經靜脈術前48小時給藥，吻合口血小板沉積明顯增加。表明小劑量阿斯匹林術前經靜脈給藥，可增加吻合口血小板沉積，但這種作用的強度有限，不足以引起吻合口血栓形成。阿斯匹林的這種作用的機制不清。阿斯匹林的半衰期較短，用藥時間和損傷血管時間間隔過長，可使其體內藥物濃度降低^﹝1﹞。有報道認為，超低劑量阿斯匹林可導致血管內血栓形成^{﹝10、11﹞}。因超低劑量阿斯匹林只抑制血管PGI₂生成，而不抑制血小板環氧酶，使TXA₂的生成增加，血栓易形成^﹝12﹞。我們研究的結果是否與這種機制有關，需進一步研究。

　　我們的研究結果表明，小劑量阿斯匹林可抑制內源性凝血系統的功能，抑制血小板聚集，這是小劑量阿斯匹林在顯微外科應用的基礎。同時也發現，小劑量阿斯匹林能使術後早期的動脈吻合口血小板沉積增加，但這種增加是有限的，不足以引起吻合口栓塞。小劑量阿斯匹林對全身和對吻合口局部的作用不一致。

　　基金項目：上海市領先學科(95-Ⅲ-1)和國家自然科學基金資助項目(392303401)

　　作者單位：安智全(上海市第六人民醫院骨科　上海，200233)

　　顧玉東(上海醫科大學附屬華山醫院手外科)

　　鐘高仁(上海醫科大學藥學院放射藥學教研室)

　　朱建華(上海醫科大學藥學院放射藥學教研室)

　　徐明光(上海醫科大學附屬華山醫院檢驗科)

　　許小風(上海醫科大學附屬華山醫院檢驗科)

　　高福琴(上海醫科大學附屬華山醫院檢驗科)

　　參考文獻

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