梭曼及其代謝產物的分析方法及應用

　　軍事醫學科學院院刊2000年第24卷第3期

　　李勁彤　阮金秀

　　摘　要　綜述了梭曼及其代謝產物分析方法以及它們在梭曼的毒理學、毒代動力學及毒檢中的應用。其中，手性毛細管柱氣相色譜法或氣質聯用儀是實現梭曼四個異構體分離測定的較好手段；對梭曼酸性代謝產物的分析測定可以作為監測梭曼中毒的有力工具。

　　關鍵詞：梭曼；代謝產物；毒代動力學

　　梭曼（soman）是難防難治的神經性毒劑，其主要毒性作用是不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶（AChE），使乙酰膽堿（ACh）積聚而產生膽堿能症狀，嚴重中毒者可迅速發生驚厥、呼吸衰竭而導致死亡。梭曼有一個不對稱的碳原子和一個不對稱的磷原子，因此有四個光學異構體，即 c(+)P(+), C(+)P(-), C(-)P(+), C(-)P(-),這些異構體的毒理學特性差別很大。其中，C(±)P(-) 對AChE抑制速率比C(±)P(+)快5個數量級，毒性大20～50倍，因此，C(±)P(-)是消旋梭曼中起主要毒性作用的一對異構體，C(-)P(-)較C(+)P(-)毒性更大。另外，梭曼的毒代動力學顯示，相對無毒的C(±)P(+)與高毒的C(±)P(-)梭曼在體內的代謝過程有顯著差異，C(±)P(+)主要通過酶水解而迅速消除，而C(±)P(-)異構體則主要通過與羧酸酯酶（CaE）及丁酰膽堿酯酶（BuChE）結合解毒^﹝1﹞。對不同的中毒途徑，四個光學異構體在體內的處置過程也有差別，如在豚鼠皮下注射或吸入梭曼較等毒劑量靜脈注射後血中C(±)P(-)高毒性異構體濃度高出近一倍^﹝2，3﹞。梭曼進入體內後迅速消除，血中僅存少量母體化合物，而尿中的酸性代謝物濃度高，半衰期長，可以作為監測梭曼中毒的化學標記物^﹝4﹞。所以，建立靈敏、特異的梭曼四個光學異構體及其代謝產物的分析方法對研究梭曼中毒後體內代謝過程、解毒藥物的藥理學評價及中毒診斷都具重要意義。本文對梭曼及其代謝產物的主要分析方法及應用情況作一綜述。

　　1　放射性同位素標記方法

　　早期的研究主要是用¹⁴C或³H標記梭曼，檢測其放射性活性來研究梭曼體內的分布與排洩。但它不能區分梭曼的非水解產物與大量的水解產物，並且用此方法不能分別研究梭曼四個異構體的代謝過程，特異性較差，因此其應用受到一定的限制^﹝5﹞。

　　2　生物學檢測方法

　　早在80年代初，Hunter等^﹝6﹞就用梭曼的單克隆抗體結合技術競爭性抑制酶免疫測定方法來檢測梭曼，但因其抗體親和力不高，特異性較差，此技術並未得到充分的應用與發展。

　　2.1　外源性酶抑制法測定血中遊離梭曼

　　目前多採用高氯酸沉澱血漿中蛋白（酶），再外加外源性AChE，通過殘留酶活性與梭曼濃度之間的線性關系來確定梭曼在血中的殘餘量。此方法操作簡單，重復性好，靈敏度高，測定範圍在18～1820 pg/ml血，測定精密度在±10%以內。此方法可作為研究梭曼毒代動力學血中殘餘量的監測手段，也適用于其他多種有機磷毒劑體內外快速檢測。但此方法主要檢測的是血中高毒性的梭曼C(±)P(-)異構體，不能精確研究C(±)P(±)四個異構體體內的代謝解毒過程^﹝7﹞。

　　2.2　基于膽堿酯酶抑制的液相色譜檢測法

　　Sipponen^﹝8﹞等用甲醇-水作流動相，在有線性梯度系統的反相色譜將梭曼分離，再用梭曼與膽堿酯酶柱後反應，以殘餘酶活性與梭曼濃度的線性關系定量梭曼。此方法檢測限可達10 pg，重復性在±1%，但也不能區分梭曼四個光學異構體而使用受限。

　　3　氣相色譜（GC）、氣質聯用（GC-MS）儀檢測梭曼四個異構體

　　真正能實現梭曼四個異構體分離測定的是手性毛細管柱的氣相色譜法或氣質聯用儀。Benschop等^﹝9﹞在1985年就以²H標記梭曼異構體作為內標，用手性毛細管柱分離，氮磷檢測器檢測實現了梭曼四個異構體的分離測定。檢測靈敏度可達250 pg。在處理血樣時，採用酸化血液（pH 4.2），加入鋁離子中和氟離子，以及加入特戊基-甲基氟膦酸酯以佔據梭曼的結合位點等方法，保持了梭曼四個異構體的穩定性。近年來，熱解吸/冷捕獲的大體積進樣（200μl）毛細管氣相色譜法的發展可使梭曼的檢測達到100 ng/L水平，為研究梭曼毒代動力學提供了有力手段^﹝10﹞。並適用于沙林、塔崩、 vX等神經性毒劑的微量測定。

　　呼吸道染毒是梭曼重要的中毒途徑，用手性毛細管柱的氣相色譜術可以研究動物呼吸道中毒後梭曼四個異構體的毒代動力學。Benschop等與Langenberg等^{﹝11，12﹞}分別用豚鼠研究發現，動物吸入梭曼數分鐘，C(±)P(-)異構體在染毒期迅速升高，其濃度-時間關系的數學模型可用非線性回歸獲得，動力學模型呈不連續過程，即染毒期單冪關系，染毒後期雙冪關系。其中，C(+)P(-)較C(-)P(-)異構體吸收相落後，可能是C(+)P(-)較多地與CaE結合的原因。而吸入中毒較等毒劑量靜脈給藥，梭曼末端半衰期長，可能由于在上呼吸道存在一個梭曼的儲存庫，染毒終止後又緩慢釋放的原因。結合梭曼的測定、血與組織中AChE的測定、梭曼水解率的測定、血與各組織勻漿梭曼結合能力的測定及心輸出量與組織血流量的測定等，可以建立起梭曼中毒的毒代動力學生理模型^{﹝12，13﹞}。

　　用GC-MS可以靈敏而準確地檢測梭曼的四個異構體，在處理血標本時，可以用高氯酸沉澱蛋白，梭曼提取率可達81%^﹝14﹞。可用此方法研究藥物對梭曼異構體體內解毒的影響。Karlsson^﹝15﹞等研究了鈣拮抗劑尼莫地平對抗梭曼兔中毒作用，發現尼莫地平可能通過肺解毒機制，降低了毒性梭曼C(±)P(-)的初始濃度。

　　4　梭曼主要代謝產物的檢測方法

　　梭曼主要代謝產物是通過酶催化水解和（或）自發水解產生的甲基磷酸頻哪基酯（PAMA）。另外，梭曼還可與CaE或BuChE能可逆或不可逆性結合，生成的PAMA由尿排洩。而梭曼對酶不可逆的膦酰化作用則使梭曼代謝產物的毒代動力學過程與沙林、塔崩等其他神經性毒劑不同，表現出更復雜、緩慢、不完全消除的特點。Shih等^﹝4，16﹞用GC-MS分析了梭曼大鼠皮下染毒後尿中PAMA的排洩速率，發現其呈雙相，t_1/2分別為3.6 h與18.5 h，早期排出的是P(+)的水解產物， 而後期排出的以P(-)的水解產物為主，總回收率僅為62%，肺是主要的蓄積器官。與酶不可逆結合的梭曼可通過加入表面活性劑（Triton-X100）與10 mol/L NaOH，在高溫高壓下水解後再提取，並用GC-MS測定PAMA來檢測。Katagi等^﹝17﹞應用陰離子交換柱的間接光度檢測器的離子色譜術（IPD-IC）檢測人血清中的PAMA，線性測定範圍為100 ng/ml～1 μg/ml血清，回收率可達72.9%。另外，Nassar等^﹝18﹞用毛細管電泳法測定PAMA，定量測定限在500 ng/ml以內，回收率可達86%以上，具有樣本制備簡單、分析迅速等優點。

　　目前，檢測PAMA最靈敏的方法是通過對PAMA進行對溴甲基甲酰苯衍生化，用在線固相提取（SPE）液相色譜連接快原子轟擊質譜（LC-MS）和串級質譜測定（LC-MS-MS），檢測範圍在0.5～3 ng/ml, 精密度在6%以下，PAMA 在血清與河水中的回收率分別是88%和94.1%，有效地提高偵毒檢毒水平^﹝19﹞。

　　梭曼及其代謝物的分析方法的進展，為深入研究梭曼毒性作用及梭曼的偵檢提供了有力的工具，在實際應用時，要根據研究的目的，各種方法的檢測靈敏度與精密度，結合現有的條件綜合考慮。

　　﹝作者簡介﹞　李勁彤(1971-)，男，甘肅蘭州人，在讀博士生。

　　李勁彤（軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京　100850)

　　阮金秀（軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京　100850）

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