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非那西丁在二乙基亞硝胺誘發肝癌大鼠的代謝
中國藥理學通報2000年第16卷第2期
崔貞福 張國慶 羅明 王華梁 王健 閻振林 賀平 錢其軍 吳孟超 郭亞軍
摘 要 目的 ①研究非那西丁在二乙基亞硝胺（DEN）誘發肝癌大鼠中的代謝，以及其它評估肝髒功能指標的改變；②血漿結合型代謝產物含量改變對非那西丁試驗的影響。方法 飲用DEN誘發大鼠肝癌，觀察血液非那西丁及利多卡因代謝產物，白蛋白和膽紅素含量，凝血酶原時間的改變；採用HPLC法測定血漿中非那西丁結合型和遊離型代謝產物含量。結果 與正常對照組相比，DEN組大鼠肝髒出現多發性癌結節，肝/體重比增加3.3倍，血漿谷丙轉氨酶、γ-谷氨酰轉肽酶和堿性磷酸酶含量明顯升高，但凝血酶原時間、血漿白蛋白、非那西丁和利多卡因代謝產物含量無明顯改變。DEN組大鼠血漿非那西丁遊離型代謝產物含量高于正常對照組43.9%（P＜0.01），但結合型＋遊離型代謝產物總量無明顯差別。結論 在DEN誘發肝癌大鼠，肝細胞嚴重受損，肝髒體積增大，非那西丁代謝等肝功能試驗無明顯改變。同時測定遊離型及結合型代謝產物含量，才能正確反映肝髒的生物轉化功能。
關鍵詞：二乙基亞硝胺 肝癌 非那西丁試驗 利多卡因試驗 大鼠
在體內，非那西丁經肝微粒體P450ⅠA2酶催化，氮位去乙基，形成對氨基乙酚（Ace）。口服或靜脈注射非那西丁後，測定血液中對氨基乙酚含量，可反映肝細胞的功能狀態。所以，非那西丁試驗作為評估肝髒功能的指標，或研究肝P450ⅠA2酶活性的模型藥物，備受推崇﹝1﹞。但是，肝髒的功能十分復雜，並受多種因素影響，臨床及動物實驗經常發現，肝細胞已嚴重受損，但功能試驗正常。值得注意的是，以往關于非那西丁、利多卡因等肝功能試驗的評價，大部分都採用急性肝損害模型，而且，只測定血液中遊離型代謝產物含量。本文用二乙基亞硝胺（DEN）誘發大鼠肝癌及肝損害，旨在研究肝細胞受損，但肝髒體積明顯增大時，非那西丁代謝等肝功能試驗有無改變，以及血漿中結合型代謝產物含量變化對非那西丁試驗的影響。
1 材料
1.1 試劑 非那西丁，DEN，葡萄糖醛酸-硫酸酶，購于Sigma公司；對氨基乙酚，購于Aldrich公司；利多卡因，上海朝暉制藥廠生產，批號：9802022；HPLC用甲醇，上海陸都實業有限公司生產，批號：96080518；單乙基甘氨酰二甲苯（MEGX）試劑盒，購于美國Abbott公司；肝功能檢測試劑盒，分別購于日本第一化學株式會社、德國寶靈曼公司和上海榮盛公司；其餘試劑均為國產分析純或優級純。
1.2 儀器 Beckman高效液相色譜系統（125型泵，168型UV-檢測器，ODSc18柱4.6×250 mm，GOLD軟件），美國Beckman公司制造。熒光偏振免疫分析儀，美國Abbott公司制造。7170A型自動生化分析儀，日本島津公司制造。
1.3 實驗動物 Wistar大鼠，♂，體重（75.2±7.2） g，由中科院上海實驗動物中心提供，清潔級，證書號005。所有大鼠分籠飼養，採用標準化光照及飲食，適應期1 wk，取血前12 h開始禁食。
2 方法
2.1 DEN誘發肝癌大鼠非那西丁代謝及其它肝功能試驗的改變 60只大鼠，隨機分成4組，每組15只。A組和B組為模型組，按文獻報道方法﹝2﹞，略加改進，在飲水中加入DEN，前50 d濃度為0.06 g*L-1，後40 d為0.08 g*L-1，自由飲用。C組和D組為正常對照，飲水中不加DEN。連續誘導90 d停DEN，再正常飼養40 d。A組與C組大鼠尾靜脈注射6 g*L-1非那西丁20 mg*kg-1，間隔30 min後，斷頭取血。B組與D組大鼠尾靜脈注射1 g*L-1利多卡因2 mg*kg-1，15 min後，斷頭取血，血液分別置于含枸椽酸鈉的抗凝管和非抗凝管內。解剖肝髒，沾除血漬。計數肝表面腫瘤結節數後，稱肝重，計算肝/體重比，統一取右葉肝組織，福爾馬林液固定，石臘包埋，制備成厚5 μm的切片，HE染色，常規組織學檢查。採用高效液相色譜法﹝3，4﹞，測定血漿非那西丁遊離型及結合型代謝產物含量，用熒光偏振免疫分析法和自動生化分析儀，測定血液利多卡因代謝產物（MEGX）含量及白蛋白（ALB）谷丙轉氨酶（ALT）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）、膽紅素（BIL）、堿性磷酸酶（ALP）含量。
Tab 1 Incidence of hepatoma induced with DEN and liver/body weight in rats(X±s,n=30)
| Group |
Body weight |
Incidence number/% |
Liver/Body weight |
| before inducing |
after inducing |
| Normal control |
74.2±7.2 |
319.2±18.9 |
0 |
0.0294±0.0048 |
| DEN |
76.3±7.12 |
33.2±17.8** |
100** |
0.1274±0.0381** |
**P＜0.01 vs normal control Tab 2 Changes of plasma aLB,BIL,ALT,ALP,γ-GT and TT in rats with DEN-induced hepatoma (X±s,n=30)
| Group |
ALB/g*L-1 |
TT/s |
BIL/g*L-1 |
ALT/U*L-1 |
γ-GT/U*L-1 |
ALP/U*L-1 |
| DEN |
28.4±2.8 |
19.6±2.4 |
8.83±3.84** |
151.8±44.6** |
31.6±16.2** |
334.5±48.3** |
| Normal contro4 |
l29.3±1.8 |
17.3±2.8 |
0.40±0.22 |
61.1±14.9 |
1.8±0.71 |
56.0±28. |
**P＜0.01 vs normal control Tab 3 Metabolism of phenacetin and lidocaine in rats with DEN-induced hepatoma(X±s,n=15)
| Group |
Ace/mg*L-1 |
MEGX/μg*L-1 |
| Free |
(%) |
Conjugation |
(%) |
Total |
| Normal control |
0.92±0.07 |
(32.7) |
1.89±0.81 |
(67.3) |
2.81±1.34 |
148.8±12.4 |
| DEN |
1.64±1.12** |
(53.0) |
1.45±0.69* |
(17.0) |
3.09±0.93 |
164.5±22.4 |
*P＜0.05,**P＜0.01 vs normal control2.2 統計學處理 所有定量資料均採用X±s表示，兩組間差異用分組t檢驗，進行顯著性檢驗。兩組間率的差異用χ2檢驗，進行顯著性檢驗。
3 結果
30只大鼠飲用DEN 130 d後，肝髒出現多發性粟粒樣結節，部分呈巨塊狀，肝癌發生率為100％。肝/體重比比正常對照組增加3.3倍。腫瘤結節組織學檢查顯示癌巢、腺瘤樣變，癌旁組織呈空泡樣變性，伴充血、水腫和灶性壞死。對照組大鼠無一只出現自發性肝癌，肝組織切片檢查未見明顯異常(表1)。由表2，3可以看出，DEN組大鼠ALT、γ-GT和ALP等反映細胞損傷的指標明顯升高（P＜0.01）；除膽紅素外，血漿白蛋白、凝血酶原時間（TT）、MTGX和非那西丁代謝產物Ace含量等反映肝髒功能的指標均無明顯改變。DEN組大鼠血漿遊離型Ace含量高于正常對照組43.9%(P＜0.01),但結合型Ace加遊離型Ace的總量無明顯差別。
4 討論
實驗結果表明，在DEN誘發肝癌的大鼠，其肝髒出現彌漫性粟粒樣結節，部分形成巨塊狀。組織學檢查，除癌巢、腺瘤樣變外，同時還伴有空泡狀變性、灶性壞死等慢性非特異性肝細胞損害。另外，肝髒體積增大，肝/體重比高于正常對照組3.3倍。血液ALT、γ-GT和ALP含量明顯升高。由此不難看出，DEN引起的大鼠肝髒損害，至少包括3個方面，①誘發肝癌；②肝細胞嚴重損傷；③肝細胞增殖，肝髒體積增大。
令我們始料不及的是，雖然DEN誘發肝癌大鼠的肝細胞嚴重受損，但血漿白蛋白含量、凝血酶原時間、非那西丁試驗和利多卡因試驗均無明顯改變。如果只測定血漿遊離型非那西丁代謝產物含量，結論反而是DEN誘發肝癌大鼠肝髒的生物轉化功能優于正常對照大鼠。實際上，肝髒的生物轉化功能由一相反應和二相反應所組成。前者包括氧化，還原和水解代謝，後者為結合代謝。絕大多數外源性化學物質進入機體後，首先進行一相反應，然後通過二相反應，與葡萄糖醛酸或硫酸結合，經腎髒和膽道排出體外。因此，體內代謝產物通常以遊離型和結合型兩種方式存在。遊離型代謝產物含量除與P450氧化酶活性有關外，還受結合酶活性影響。肝細胞損傷時，結合代謝酶活性降低，勢必影響遊離型代謝產物含量。在我們的實驗中，DEN組大鼠血漿非那西丁代謝產物總量與正常對照組並無明顯差別，但由于結合型Ace含量比正常對照組減少20.3%,造成遊離型Ace含量相對升高。如按常規方法，只測定遊離離型Ace含量，則會作出DEN大鼠肝髒生物轉化功能增強的錯誤結論。
利多卡因試驗類似于非那西丁試驗。其原理是，利多卡因被靜脈注射後，經肝P4503A酶特異性代謝,形成MEGX。所以，測定血液中MEGX含量，可反映肝髒的生物轉化功能。近年來，利多卡因試驗被廣泛用于臨床和藥理學實驗，尤其是肝移植手術，用其評估供肝的功能狀態。在我們的實驗中，DEN組大鼠MEGX含量不但不降低，反而高于正常對照組大鼠10.4%。其是否也與結合型代謝產物含量改變有關，本文不能作出結論。另外，我們注意到，最近有不少作者也報道﹝6，7﹞，利多卡因試驗不能真實反映慢性肝病患者的肝髒損傷情況。在此，我們呼籲臨床及藥理學工作者，做肝髒生物轉化功能試驗時，不宜只測定遊離型代謝產物含量。
血漿白蛋白含量和凝血酶原時間主要與肝髒蛋白合成功能有關，也是臨床評估肝髒功能的重要指標。在DEN誘發肝癌的大鼠，血漿白蛋白含量、凝血酶原時間、非那西丁試驗和利多卡因試驗均無明顯改變。理論上，正常肝髒動用1/4的功能，就能維持機體新陳代謝的需要，剩餘的3/4功能被稱之為肝髒儲備功能。患肝髒疾病時，如果動用了肝髒儲備功能後，仍不能維持機體代謝的需要，肝細胞則大量增生，肝髒體積增大、發揮代償功能。在我們的實驗中，DEN組大鼠肝髒體積明顯增大，肝/體重比高于正常對照組3.3倍，從而維持了肝髒功能的相對正常。顯然，做肝功能檢查時，最好同時採用B型超聲或CT等物理學方法，從形態和功能兩個方面進行綜合分析判斷。
作者簡介：崔貞福，女，44歲，副研究員；吳孟超，男，教授，中科院院士崔貞福（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因治療中心，上海 200438)
羅明（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因治療中心，上海 200438)
閻振林（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因治療中心，上海 200438)
賀平（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因治療中心，上海 200438)
錢其軍（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因治療中心，上海 200438)
吳孟超（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因治療中心，上海 200438)
郭亞軍（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因治療中心，上海 200438)
張國慶（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因藥械科，上海 200438)
王華梁（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因檢驗科，上海 200438)
王健（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院腫瘤免疫基因檢驗科，上海 200438）
參考文獻
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