人腦膠質瘤尿激酶型纖溶酶原激活因子及其抑制因子表達的研究^＊

　　中國腫瘤臨床1999年第26卷第7期

步星耀　章翔　王連剛　于耀宇　易聲禹

　　 摘　要　目的：研究53例人腦膠質瘤和8例正常腦組織uPA、PAI₁、PAI_２表達水平。方法：採用免疫組化方法。結果：在8例正常腦組織中，uPA、PAI₁和PAI_２表達陰性，低級別（Ⅰ、Ⅱ）膠質瘤uPA、PAI₁表達水平較低，而高級別（Ⅲ、Ⅳ）膠質瘤uPA、PAI₁表達水平顯著升高（P〈0.05 ）

　　關鍵詞：膠質瘤　纖溶酶原激活因子　纖溶酶原激活因子的抑制因子

　　人腦膠質瘤的惡性表型以局部侵襲和血管生成為主要特征。細胞外基質的蛋白分解是腫瘤細胞浸潤和侵襲過程中腫瘤血管化所必需的第一步。纖溶酶原激活因子（plasminogen activators,PAS）催化纖溶酶原向纖溶酶的轉化，後者可降解大量的組織蛋白，並將無活性的膠原酶原轉變成有活性的膠原酶，從而降解膠原類基質。研究發現，高水平的尿激酶型PA（uPA）與腫瘤的侵襲過程密切相關^[1]；多種腫瘤組織的惡性發展伴有uPA的抑制因子1型（PAI₁）和2型（PAI_２）量的變化^[２]。本研究採用免疫組化方法研究uPA、PAI₁、PAI_２在正常腦組織和各級別膠質瘤組織中的表達，探討其與生物學行為的關系。

　　1　材料與方法

　　1.1組織標本

　　本院存檔的石蠟包埋膠質瘤組織53例，均經HE染色，病理組織學檢查證實。其中膠質瘤Ⅰ級3例，均為毛細胞型星形細胞瘤。Ⅱ級20例，包括原漿型星形細胞瘤11例、纖維型星形細胞瘤9例。Ⅲ級13例，包括間變型細胞瘤11例，星形母細胞瘤2例。Ⅳ級17例，包括膠質母細胞瘤14例，髓母細胞瘤3例。正常腦組織8例由減壓術中取得。

　　1.2免疫組化研究

　　鼠抗人uPA、PAI₁和兔抗人PAI_２多抗由Diagnostica公司生產，ABCKit由Dako公司生產。主要步驟：1)5μm厚切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。2)加uPA或PAI₁單抗，PAI_２多抗，4℃過夜。3)加生物素化鼠/兔抗IgG40分鐘。4)加ABC復合物60分鐘。5)0.04％DAB－HO顯色。6)蘇木素復染後，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

　　以PBS代替一抗作對照染色，細胞漿有棕黃色顆粒者為陽性標記。陽性細胞數為0記作(－)，陽性細胞數佔腫瘤細胞數25％以下為(＋)，25％～75％為(＋＋)，＞75％為(＋＋＋)。

　　1.3統計學處理

　　採用Mann－Whitney檢驗和等級相關分析。

　　2　結果

　　2.1uPA表達

　　uPA陽性染色為定位于腫瘤細胞胞漿的棕黃色顆粒，增殖的血管內皮細胞亦陽性顯色（圖1）。8例正常腦組織均未見uPA表達；膠質瘤病理分級與uPA表達，隨病理分級的增高，各級間的陽性細胞檢出率亦隨之增高（附表）。除Ⅰ級與Ⅱ級無顯著性差異外（P＞0.05），其餘各級間比較均有顯著性差異（P〈0.05）。

　　圖1ABC免疫組化染色，人腦膠質瘤Ⅳ級uPA表達陽性，陽性染色定位于腫瘤細胞胞漿，呈棕黃色×400

附表uPA、PAI₁在人腦膠質瘤的表達

　　2.2PAI1表達

　　PAI₁陽性染色定位于腫瘤細胞胞漿，呈棕黃色，血管內皮細胞、基底膜及週圍結締組織亦可見陽性顯色（圖2）。8例正常腦組織均未見PAI₁陽性表達；膠質瘤的PAI₁表達隨病理分級的增高，陽性細胞檢出率亦隨之增高（附表）。除Ⅰ、Ⅱ級間無統計學意義外（P＞0.05），其餘各級間比較均有顯著性差異（P〈0.05）。

　　圖2　人腦膠質瘤Ⅲ級PAI1，表達陽性，定位于腫瘤細胞胞漿，呈棕黃色，血管內皮細胞、基底膜及週圍結締組織亦可見陽性顯色×200

　　2.3uPA和PAI₁在腦膠質瘤表達關系

　　在本組53例腦膠質瘤組織中，uPA與PAI₁表達呈顯著正相關（r=0.51,P〈0.01）。

　　2.4PAI_２表達

　　8例正常腦組織表達陰性；53例膠質瘤組織僅3例PAI_２呈低表達，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ級各1例，陽性染色主要定位腫瘤細胞胞漿。

　　3　討論

　　惡性腫瘤侵襲臨近正常組織的能力，涉及到腫瘤細胞生長和播散到週圍正常組織屏障的破壞，在此過程中，腫瘤細胞分泌的PAs提供了關鍵性的細胞分子作用機制^[3]。uPA既可以酶原形式，也可以活性酶形式結合到特定的細胞表面受體，使纖溶酶原活化成纖溶酶，與其它蛋白分解酶一同引起組織降解和細胞遷移，在腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮重要作用^[4]。本研究中，隨人腦膠質瘤分級的增高，腫瘤惡性程度增加，uPA表達水平顯著性升高，而正常腦組織則無uPA表達，表明uPA在膠質瘤的發生和演進過程中的作用可能通過增加腫瘤細胞的侵襲力來實現。

　　Moonen^[5]等用新生大鼠小腦顯微移植的星形膠質細胞，觀察uPA對膠質細胞的有絲分裂作用，發現提呈的人uPA可明顯促進星形膠質細胞增殖。因此推論，腦損傷的原發效應是uPA增多，進而誘發膠質細胞增生。雖然有學者認為損傷是腦腫瘤的誘因，但是，損傷與腦腫瘤的確切關系尚有待闡明。Hsu等^[3]最近的研究中發現，臨近腫瘤或瘤細胞浸潤的腦組織，反應性星形細胞uPA表達陽性。結合本實驗結果，作者認為uPA促膠質細胞增殖作用可能介導膠質細胞的惡性轉化，在膠質瘤發生和發展過程中，促進其惡性演進。

　　機體內蛋白酶與蛋白酶抑制物相互協調、相互作用，保持著體內的調節平衡。PAS活性受PAI1和PAI_２的調節，後二者皆為絲氨酸蛋白酶抑制物超家族（Serpin）的成員，與PAI_１相比，PAI_２是uPA更為特異的抑制物。在細胞水平和動物模型上，已證明PAI_２可有效抑制腫瘤細胞的侵襲^[６]。本實驗中，PAI_２在膠質瘤組織偶有低表達，可能是膠質瘤發展過程蛋白酶抑制物表達失衡的表現，確切機理尚需進一步研究。PAI_１在乳腺組織中的升高與uPA相平行^[７]；本實驗中，膠質瘤組織PAI_１表達水平與uPA表達呈顯著正相關，表明PAI_１在保護由uPA引起的自身組織細胞降解方面起重要作用，在一定程度上促進了腫瘤的發展。

　　Yamamoto等^[8]研究發現，惡性膠質瘤血管內皮細胞PAI_１mRNA呈高表達；本研究證實，PAI_１蛋白定位于血管內皮細胞、基底膜及管週結締組織，表明PAI_１與膠質瘤血管生成有關。腫瘤的發生和發展依賴于腫瘤血管生成，同時，腫瘤血管生成的本身就具有一定的侵蝕性，瘤細胞可沿由新形成的血管所開啟的組織裂隙向外侵襲至週圍組織^[9]。PAI_１正常腦組織無表達，低度惡性級別膠質瘤PAI_１低表達，高級別膠質瘤PAI_１過表達，提示PAI_１在膠質瘤的惡性發展中的作用可能與其促膠質瘤血管生成有關。

　　＊本文課題受國家博士後基金資助

　　作者單位：步星耀　章翔　于耀宇　易聲禹　第四軍醫大學西京醫院神經外科（西安市710032）　王連剛　第四軍醫大學西京醫院實驗外科

參考文獻

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　　2　Boucher C,Spyratos F,Martin PM,et al.Prognostic value of urokinase-type plasminogen activator(uPA)and plasminogen ac-tivator inhibitor PAI₁ and PAI₂ in breast carcinomas.Br J Cancer,1994;69:398

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　　8　Yamamoto M,Sawaya R,Mohanam S,et al.Expression and cel-lular localization of messenger RNA for plasminogen activator in-hibitor type 1 in human astrocytomas in vivo.Cancer Res,1994;54:3329

　　9　高進,主編.癌的侵襲與轉移.北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社,1996：187