CS2對原代星形膠質細胞的毒性研究

衛生毒理學雜志 1999年第1期第13卷 論著

作者：高豔華　梁友信　傅慰祖　張勝年

單位：高豔華　梁友信　(上海醫科大學勞動衛生學教研室　200032)； 傅慰祖　張勝年　(上海市勞動衛生職業病防治研究所)

關鍵詞：二硫化碳；細胞毒性；星形膠質細胞；Na+-K+-ATP酶

　　內容摘要　為探討CS₂的神經毒性機制及體外評價方法，我們研究了CS₂對原代星形膠質細胞的毒性，採用常規培養方法，觀察CS₂染毒(0，10，100，1000，10000μmol/L對星形膠質細胞脫落、細胞形態學、及Na⁺-K⁺-ATP酶活性的影響。結果表明：CS₂染毒可使細胞脫落數增加，且與接觸劑量和接觸時間有關；細胞形態學明顯異常，電鏡下觀察表現為髓樣小體的形成及空泡樣改變；Na⁺-K⁺-ATP酶活性下降。提示CS₂對于星形膠質細胞有明顯的毒性，此酶活性的下降可作為CS₂毒性的一種標志物。

Cytotoxic effects of CS₂ on the cultured astrocytes in rats

Gao Yan-hua　Liang You-xin　Fu Wei-zu et al.

　　(Dept．Occupational Health，Shanghai Medical University，200032)

　　Astrocytes were cultivated with CS₂ at levels of 10,100,1000,10000μmol/L,respectively.The detached cells increased with the increase of CS₂ concentration and exposure duration.By light microscope,the morphologic characteristics were observed changed in CS₂-treated cells.Mitochondria Swelling,endoplasmic rcticulum cnlarging and corpus mcdullar incrcasing were found using EM.There was also a significant reduction of Na⁺-K⁺-ATPase activity in CS₂ treated cells.

　　Key words:carbon disulfide;astrocyte;cytotoxicity;Na⁺-K⁺-ATPase

　　外源性化學物神經毒作用的評估目前在國內外引起了廣泛關注^﹝1﹞。據估計大約有800多種工業毒物可引起神經行為改變，20000種化學物與神經毒作用有關，其中有機溶劑佔很大的比例。細胞培養具有細胞單一、觀察直接等優點，已成為篩選神經毒物，探索毒作用機制的重要方法^﹝2，3﹞。CS₂屬神經性毒物，對于其毒作用機理尚有許多問題有待解決。近年來，有研究認為星形膠質細胞增生為有機溶劑中毒的共同標志物^﹝4﹞，這種增生性反應與毒物所引起的多種毒性效應密切相關。因此，本研究通過細胞培養，在體外直接觀察CS₂對于原代培養星形膠質細胞的影響，以探討CS₂的毒作用機理，同時也為其它神經性毒物的體外評價方法提供借鑑。

　　材料與方法

　　1.試劑與藥品：Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)培養基，Gibco公司；胰蛋白酶，Sigma；小牛血清，上海醫科大學放醫所；GFAP(Glical fibrillarg Acidic Protein)多克隆抗體、羊抗兔IgG抗血清、正常羊血清、兔過氧物酶抗過氧化物酶(PAP)，上海醫科大學病理教研室；青霉素、鏈霉素，上海延安制藥廠；二胺基聯苯胺(DAB)，Dako公司。

　　實驗動物：SD新生大鼠(1～3天齡)，由上海醫科大學動物部提供。

　　2.分離培養方法：^﹝5﹞

　　無菌狀態下，將1～3天齡大鼠斷頭，迅速取腦，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，去除血管組織，取皮層，充分剪碎後移入含有終濃度為0.25%胰蛋白酶的DMEM培養液中，充分混勻，37℃溫育15分，加入1ml小牛血清終止反應，並加D-Hank's營養液清洗，1500r/min離心15分，共3次，棄上清，加入DMEM營養液，混勻，以血球計數板計數，調整細胞濃度為6×10⁵/ml,並以苔盼藍檢查細胞存活率大于95%，將此濃度細胞懸液1ml接種于35mm塑料培養皿中，置于37℃、5%CO₂培養箱中孵育，48小時後以D-Hank's液清洗，以除去碎片及少量細胞團塊，並更換培養液，以後每週換液2～3次。

　　3.星形膠質細胞的免疫組化：^﹝6﹞

　　取貼壁的星形膠質細胞，用PBS洗滌(3×5分)，然後在4%的多聚甲醛中固定20～30分；再以PBS洗滌(3×5分)，加正常羊血清(1︰20)，室溫30分；加1︰400免抗牛GFAP抗體，4℃下過夜；如前洗滌；再加羊抗免IgG抗體(1︰200)，37℃孵育30分；如前洗滌，加兔PAP(1︰200)37℃作用30分，再以PBS洗滌5分；DAB顯色1分，以PBS充分洗滌，經各級酒精脫水，二甲苯透明，最後以中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

　　4.染毒途徑及測試指標：

　　星形膠質細胞培養成熟(2週左右)後，加入終濃度為0，10，100，1000及10000μmol/L的CS₂。

　　(1)生長與脫壁的研究：分別于0，12，24，48，72小時後吸出培養液，離心後在顯微鏡下計數，以得到每皿脫落細胞數。

　　(2)形態學觀察：星形膠質細胞染毒後，每天在倒置相差顯微鏡下觀察；與CS₂共培養72小時的細胞經PBS清洗後，以2.5%戊二醛固定，常規制備電鏡標本，在JEDL JEM-1200EX Electron Macroscope下觀察，並拍攝照片。

　　(3)Na⁺-K⁺-ATP酶的測定：在與CS₂共同培養72小時後，吸出培液，加入0.25%胰蛋白酶0.5ml，37℃作用20分，以小牛血清終止反應，經清洗後，收集細胞用于測定Na⁺-K⁺-ATP酶活性^﹝7﹞。結果用染毒組酶活性佔對照組的百分比表示。

　　結　　果

　　1.生長與脫壁：

　　接種12小時後，大部分細胞開始貼壁，少數細胞有突起，呈多角形。48小時後，細胞呈生長狀態，為多角形；再以每兩天分裂一次的速度增殖，培養10天後，細胞在培養皿內形成均勻單層貼壁，細胞呈梭形。以PAP法作免疫組化，證實分離的細胞為星形膠質細胞。待培養成熟後，加入含不同CS₂濃度的二甲基亞