兒童6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶缺乏症的篩查

　　中華醫學雜志2000年第80卷第7期

　　葉軍　劉曉青　黃曉東　沈永年　陳瑞冠　顧學範

　　摘　要　目的　了解高苯丙氨酸血症患兒中6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶缺乏症(PTPSD)的發病率及PTPSD患兒臨床轉歸情況。方法　用高效液相層析儀(HPLC)對69例苯丙酮尿症(PKU)患兒作尿新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)測定，對異常者進行四氫生物蝶呤(BH₄)負荷試驗、6-丙酮酰四氫蝶呤(PTPS)基因突變檢測及BH₄、多巴、5-羥色氨酸治療。結果　69例中9例診斷為PTPSD，其尿N/B＞38，B%＜5%。4例患兒中有4種PTPS基因突變類型，即P87S、N52S、D96N及G144R(新突變類型)。3例嚴重型患兒經治療後體格發育良好，智商(IQ)70～80分，語言發育落後。1例部分型患兒未予特殊治療，生長及智能發育正常。結論　對血苯丙氨酸增高者均需要進行四氫生物蝶呤缺乏症的篩查，可降低誤診率。

　　關鍵詞：苯丙酮尿症　缺乏症　基因

　　隨著我國對新生兒苯丙酮尿症(phenylketonuria, pKU)篩查工作的推廣，許多由于苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)缺乏所導致的經典型PKU患兒得到了早期的診治，智能發育接近正常。但有部分非典型PKU或高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia, hPA)者因其PAH的輔基----四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH₄)缺乏而影響苯丙氨酸(phenylalanine, phe)代謝及腦內神經遞質(如多巴胺、5-羥色胺)合成，臨床上易誤診為PKU；BH₄缺乏常因其合成代謝途徑中6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶(6-pyruvoyl-tetrahydrobiopterin synthase, PTPS)缺乏所致，其預後比經典型PKU更差，治療方法也截然不同于經典型PKU。我們總結了十餘年來對部分PKU患兒進行BH₄缺乏症(BH₄ deficiency, BH₄D)的篩查診斷、基因突變分析、特殊藥物療效和臨床診治經驗。

　　對象和方法

　　一、對象

　　1.自1981～1997年在我院小兒內分泌遺傳代謝門診診治的700餘例PKU患兒中，97例經新生兒群體篩查或PKU高危篩查診斷，其餘均因智能落後、發黃等原因來診而診斷。所有這些患兒中，除了10餘例診斷為PHA(血Phe＜960μmol/L)外，餘均診斷為經典型PKU(血Phe＞1 200 μmol/L)。經得患兒家長的同意，對69例PKU患兒進行了BH₄D的篩查。

　　2.對BH₄D者及其父母進一步作PTPS基因突變檢測，並採用特殊藥物對患兒進行對症治療。

　　二、方法

　　1.尿蝶呤譜分析：用美國Waters公司510型高效液相層析儀(HPLC)，用反相層析法對PKU患兒進行尿新蝶呤(neopterin, n)、生物蝶呤(biopterin, B)含量測定。如尿新蝶呤與生物蝶呤比(N/B)顯著增高，B%＜10%，為BH₄合成酶PTPS缺乏(PTPSD)；N/B降低，B%增高，為還原酶DHPR缺乏。

　　2.BH₄負荷試驗：尿蝶呤異常者進一步作該試驗以助診。試驗前3 d給普食，使血Phe上升＞960 μmol/L，口服BH₄(7.5 mg/kg)，服前，服後2、4、6、8 h分別取血作Phe測定，此外，服前，服後4～8 h可分別留尿作尿蝶呤分析。

　　3.PTPS基因突變分析：抽取PTPS患兒及父母靜脈血，分離淋巴細胞，提取總RNA，再經反聚合酶鏈反應(RT-PCR)，即以RNA為模板，加入oligo dT、反轉錄酶MMLV、dNTP和緩衝液等，在聚合酶鏈反應(PCR)儀中42℃，反應60 min，反應總體積20 μl。取cDNA 5 μl，分別加入5種引物來擴增PTPS基因DNA序列。最後採用Sanger雙脫氧鏈末端終止測序法進行DNA測序。

　　4.BH₄D治療：一經診斷立即給予BH₄片1～5 mg*kg^-1*d^-1以降低血Phe濃度及神經遞質前質左旋多巴(L-DOPA)5～15 mg*kg^-1*d^-1，5-羥色氨酸(5-HTP)5～10 mg*kg^-1*d^-1聯合治療。治療期間隨訪血Phe濃度、體格、智能發育及神經系統症狀。

　　結果

　　一、尿蝶呤分析

　　69例HPA患兒尿蝶呤測定結果見表1。60例PKU者平均尿新蝶呤(N)和尿生物蝶呤(B)含量高于正常兒童參考值(N：0.28～2.6 mmol/molCr，B：0.35～2.96 mmol/molCr)；N/B稍增高(正常：0.3～0.94)，生物蝶呤百分比(B%)在正常範圍(42.7%～75.9%)，符合經典型PKU診斷。其中9例患兒尿N/B極度增高至38以上；而B極低甚至測不出，B%＜5%，故診斷為PTPS缺乏症。

　　二、BH₄負荷試驗

　　3例尿蝶呤分析疑診為PTPSD者作了此試驗。試驗前血Phe為720～1200 μmol/L，口服BH₄片7.5 mg/kg後6 h血Phe逐漸降至120～240μmol/L。1例同時作尿蝶呤分析，試驗前B%為0.1%，口服BH₄片後6 h增高至20.3%。進一步證實PTPSD診斷。

　　三、PTPSD患者家系基因突變檢測

　　4例PTPS患兒及父母接受了全長cDNA分析，發現4種基因突變，即在第259位堿基發生C→T置換，使編碼區87位脯氨酸(Pro)轉換為絲氨酸(Ser)(P87S)；在第286位堿基發生G→A置換，使編碼區96位門冬氨酸(Asp)轉換成門冬酰胺(Asn)(D96N)；在第155為堿基發生A→G置換，使編碼區52位門冬酰胺(Asn)轉換成絲氨酸(Ser)(N52S)；在第430位堿基發生G→C置換，使144位甘氨酸(Gly)轉換為精氨酸(Arg)(G144R)。G144R是國際上尚未報道的基因突變類型。4例患兒其PTPS突變基因為P87S/D96N，P87S/N52S，N52S/G144A及D96N/P87S，分別來自各自的父母親，符合常染色體隱性遺傳規律。

　　四、PTPS患兒治療轉歸

　　9例患兒(男5例，女4例)中4例經新生兒篩查診斷為PKU，5例因智能障礙就診而診斷為PKU。這些患兒經低或無Phe奶粉治療後，雖血Phe濃度很快下降至360μmol/L以下，卻出現進行性的肌張力低下，軟弱無力，抬頭困難，有的伴隨頑固性抽痙。PTPSD患者平均診斷年齡為1.6歲(2月至6歲)。5例因診斷當時無特異性藥物治療或放棄治療，其中4例已死亡。1例部分型PTPS缺乏，在3個月確診後因無任何神經系統症狀，僅給低Phe奶方治療至8個月，血Phe在120～240μmol/L。6歲時IQ為82分。另3例分別在生後2個月、6個月、6歲診斷為嚴重型PTPSD，診斷後用神經遞質前質及四氫生物蝶呤治療，即L-DOPA(5～10 mg/kg)，5HTP(5～6 mg/kg)，每日總劑量分3～4次口服，BH₄片1～2 mg/kg，分2次口服。這些患者治療後神經系統症狀逐漸改善，肌張力恢復正常，生長發育逐步趕上並接近正常兒童。智能發育雖明顯提高，但仍有一定的

表1　苯丙酮尿症及四氫生物蝶呤缺乏症患兒尿蝶呤分析結果(x±s)

　　落後，其中2例智能測定結果顯示智商為70～80分。患者血Phe濃度均控制于120～360μmol/L。此外，在治療期間患者有時會出現一過性的“On-Off”現象，即精神振奮，反應增加與精神萎靡不振，軟弱無力，嗜睡等交替出現，當將每日L-DOPA總劑量分成4～6次服用，則上述現象改善。

　　討論

　　PTPS缺乏所致BH₄D也是一種特殊類型的PKU，過去因無特異性治療導致死亡率極高，故稱惡性PKU^﹝1﹞。根據1996年國際統計資料分析^﹝2﹞，BH₄缺乏症中以PTPS缺乏最常見，全世界PTPSD共181例，我國大陸僅發現24例。為了降低誤診率，對所有PKU患兒進行BH₄D的篩查鑑別診斷，使患兒得到早期對症治療，預防或減輕患者的智能障礙十分重要。該組在41例新生兒群體篩查診斷的PKU中篩查出3例PTPSD缺乏性BH₄D，發病率7%，高于白種人發病率1%～3%。

　　HPLC尿蝶呤分析是目前BH₄D常用的篩查手段。血Phe增高可刺激GTP環化水解酶刺激蛋白(P35)導致尿新蝶呤和生物蝶呤水平增高^﹝1，3﹞，該文60例PKU患兒尿蝶呤結果也如此。PTPS缺乏者對Phe耐受性較強，有的僅為輕度血Phe增高，因生物蝶呤合成障礙，B%極低甚至測不出，故N/B顯著增高。因BH₄D者其PAH活性正常而穩定性下降，故當補充BH₄後4～6 h，血Phe很快下降，而經典型PKU因PAH缺乏，故BH₄對其無效。因此，尿蝶呤分析和BH₄負荷試驗是診斷BH₄D的有效手段，有條件作PTPS酶活性測定以確診。

　　1992年Thony等克隆了人類肝細胞PTPS的cDNA，PTPS基因位于第11號染色體(11p22.3)，全長2 kb，6個外顯子。文獻報道了中國PTPSD患者的基因突變類型有R25G，N52S，V56M，V70D，P87S，D96N及T106M7種，其中P87S和N52S為最常見，佔70%，P87S多見于中國南北方BH₄D患者，N52S則多見于南方患者^﹝3，4﹞。該組發現的G144R是國際上未報道的突變類型。對基因突變與臨床表型分析得出，N52S，P87S及D96N與嚴重型PTPS缺乏有關；V56M與輕型PTPSD有關^﹝3﹞。本文8例患者因腦內神經遞質合成障礙而出現嚴重的肌張力低下，屬嚴重型PTPSD，其中4例患者的基因突變類型與臨床表型相符。1例屬部分型或外週型PTPSD，其剩餘的酶活性所產生的BH₄尚能滿足腦內神經遞質合成，僅表現為PAH功能不足而出現血Phe增高，無其他神經系統症狀^﹝5﹞。

　　PTPSD的成功治療必須盡早採用BH₄、L-DOPA及5-HTP聯合治療。本組3例嚴重型患兒治療後雖體格發育進展良好，但智能發育，尤其是語言仍有落後，與一些國外報道相仿。該組長期研究探討所得臨床經驗：(1)3個月內治療者，其療效顯著。(2)聯合藥物治療療效比單獨一種藥物更顯著，在無BH₄治療的條件下，可用低Phe奶粉替代。(3)L-DOPA及5-HTP治療從小劑量逐漸增加至治療劑量，並總量至少分3～4次，以減少血漿L-DOPA半衰期短所產生的“On-Off”現象^﹝6﹞。如果加入L-deprenyl，一種單胺氧化酶B的抑制劑聯合治療，可減少“ON-Off”現象發生^﹝7﹞。(4)根據臨床症狀，血泌乳素(PRL)水平^﹝8﹞，有條件可根據腦積液神經遞質代謝產物水平來調節藥物劑量。(5)嚴格控制血Phe濃度在＜240μmol/L，避免血Phe濃度增高幹擾神經遞質前質的治療療效。

　　作者單位：葉軍（200092上海市兒科醫學研究所)

　　劉曉青（200092 上海市兒科醫學研究所)

　　黃曉東（200092 上海市兒科醫學研究所)

　　沈永年（200092 上海市兒科醫學研究所)

　　陳瑞冠（200092 上海市兒科醫學研究所)

　　顧學範（200092 上海市兒科醫學研究所）

　　參考文獻

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