鐮刀菌毒素與黃曲霉毒素的聯合毒性研究--AFB₁和DON的RDS實驗

　　衛生研究2000年第29卷第6期

李斌　郭紅衛

　　摘 要：為了解黃曲霉毒素(AFB₁)與鐮刀菌毒素的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)對DNA損傷修復的影響，用化學物質誘導的細胞增殖的變化實驗，(replicative dNA synthesis, RDS)實驗進行研究。結果表明：AFB₁和DON均可誘導細胞分化的S期DNA的合成，並且二者間存在交互作用。結果提示：AFB₁與DON在腫瘤的發生中既以遺傳毒性物質的形式發揮作用，又以非遺傳毒性物質的形式共同發揮作用。

　　關鍵詞：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；黃曲霉毒素；聯合毒性

　　RDS實驗(replicative DNA synthesis)可反映細胞合成量的改變，是反映非基因毒性致癌物(nongenotoxic carcinogen)的良好指標。有人報道，RDS可測定80%Ames實驗為陰性的非基因致癌物質^﹝1﹞。在遺傳毒性研究中，RDS實驗可作為未排定的DNA合成(unscheduled dNA synthesis,UDS)實驗的良好補充。

　　由于黃曲霉毒素與單端孢霉烯族毒素共同污染糧谷類的現象非常普遍^﹝2，3﹞。當霉菌毒素進入機體後，其作用可能相互影響，它們之間可能具有交互作用，應當引起人們的足夠重視。研究表明霉變的糧食中含有致突變、促癌和致癌物，可能是腫瘤高發的原因之一^﹝4﹞。為此，本文採用RDS實驗對黃曲霉毒素B₁(AFB₁)與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的聯合遺傳毒性進行了研究。

　　1　材料與方法

　　1.1　儀器及試劑

　　Beckman LS 6500液體閃爍計數儀；多頭細胞收集儀；大鼠離體肝髒灌流裝置(由超級恆溫器、灌流儀、恆流泵3部分組成)；放射性同位素³H-TdR；混合氣體(95%O₂，5%CO₂)；台盼藍試液。

　　1.2　閃爍液

　　2，5-二苯基惡唑(PPO)4g，1，4-雙-2-15-苯基惡唑苯(POPOP)0.4g，溶于1000ml二甲苯中。

　　1.3　Hank's液

　　NaCl 8.00g,KCl 0.40g，KH₂PO₄ 0.06g,NaHCO₃0.35g，MgSO₄^．7H₂O0.20g,CaCl₂^．2H₂O 0.154g,Na₂HPO₄^．12H₂O0.134g,葡萄糖 1.00g，酚紅 0.02g，加蒸餾水至1000ml，調pH值至7.4^﹝5﹞。

　　1.4　灌流液

　　由緩衝液A、B、C 3部分組成，其組成成分如下：

　　Buffer A為改良的Hank's液加0.5mmol/L乙二醇雙醚四乙酸(EGTA)；Buffer b為含0.05%Ⅳ型膠原酶(Sigma產品)及4mmol/L Ca²⁺的改良Hank's液；Buffer c為含1%牛血清白蛋白的Kerbs-Henseleit Buffer。以上緩衝液的pH值均調整到7.4，37℃恆溫水浴預熱。

　　1.5　正交表的確定和實驗濃度

　　選用L₉(3⁴)正交設計表。以AFB₁和DON對動物的LD₅₀及細胞毒性，分別確定AFB₁和DON的第一作用水平為1.0μg/ml，以此劑量連續稀釋10倍，分別得到第二(0.1μg/ml)及第三(0.01μg/ml)作用水平劑量的濃度。

　　1.6　RDS實驗步驟

　　1.6.1　灌流分離肝細胞　選用SD雄性大鼠，體重180～250g，(上海醫科大學實驗動物部提供)。乙醚吸入麻醉大鼠，中腹切口，打開腹腔，將200U肝素注入下腔靜脈，夾住門靜脈，近肝側45°切口、插管、結扎；用Buffer a 50ml先充盈肝髒，剪斷下腔靜脈，小心分離肝髒，摘下並放入37℃生理鹽水，洗去血凝塊，放入37℃灌流儀以100ml buffer A灌流4min，以洗去肝中殘血，然後用含膠原酶的Buffer B灌流20min，流速為40～50ml/min，使肝髒外觀呈黃色，腫脹，疏鬆；以不含酶的Buffer c 40～50ml衝洗灌流肝髒，以洗去其內的膠原酶。將肝髒浸入50ml buffer C中，剪去被膜，使肝細胞鬆散解離，用多層紗布過濾以除去結締組織，濾液以500r/min離心2min，用Hank's液洗滌3次以除去殘留的膠原酶，獲得肝細胞，用台盼藍實驗得存活率大于90%，計數肝細胞濃度，用DMEM(含5%小牛血清，0.2%白蛋白)稀釋至1×10⁵個/ml的肝細胞懸液。

　　1.6.2　CPM值的測定　將毒素溶解于甲醇中，取1ml于5ml試管中，以氮氣吹幹，然後將1×10⁵個/ml的肝細胞懸液分裝其中，使其終濃度為實驗濃度，每個濃度分3個平行樣品，以不加毒素的正常細胞懸液作為陰性對照，陽性對照為苯巴比妥鈉液(100μg/ml)。每管加³H-TdR185Bq/ml，37℃恆溫水浴培養3h，然後用2ml冰生理鹽水終止反應，用多頭細胞收集儀收集細胞至濾膜上，用蒸餾水抽洗2次，依次用5%三氯醋酸固定，75%乙醇洗滌，100%乙醇脫水，烘幹後，將紙片放入液閃杯中，加入0.5ml閃爍液，用Beckman lS 6500液體閃爍計數儀測定放射性CPM值。

　　1.7　結果判斷依據

　　將CPM值進行平方根轉換後作Dunnett t檢驗以判斷結果，當實驗組與陰性對照組的CPM值比較差異有顯著性(P＜0.05)或有非常顯著性(P＜0.01)時，判斷為陽性。並根據下式求出DNA的放射比活性R值：

　　正交實驗設計方差分析按文獻進行^﹝6﹞。

　　2　結果

　　由表1、2可見，AFB₁和DON單獨及交互作用對RDS實驗的CPM值的影響有統計意義。AFB₁對DNA誘導的單獨作用水平依次為第二作用水平＞第三作用水平＞第一作用水平。3個作用水平的CPM值均高于陰性對照(P＜0.01)。DON對DNA誘導的單獨作用水平依次為第一作用水平＞第三作用水平＞第二作用水平。3個作用水平的CPM值均高于陰性對照(P＜0.001)。AFB₁和DON聯合的誘導作用以AFB₁為第二作用水平、DON為第一作用水平時為最高；AFB₁為第一作用水平、DON為第三作用水平時為最低。通過對AFB₁和DON的RDS測試，發現AFB₁和DON可單獨和聯合誘導S期DNA的合成。

表1　AFB₁和DON的RDS實驗結果

表2　AFB₁和DON聯合作用時的CPM值

　　3　討論　　RDS實驗可反應細胞合成量的改變，是反應非基因毒性致癌物的良好指標。當DNA受外來物損傷時，細胞S期合成過程出現錯誤時，即可引起基因突變。根據此原理可在DNA水平上檢測化學物質的損傷作用。有人報道，RDS可測定80%Ames實驗為陰性的非基因致癌物質^﹝1﹞，表明兩者具有很好的相關性。研究表明在遺傳毒性研究中，RDS實驗可作為UDS實驗的良好補充。

　　利用哺乳動物細胞實驗是檢測化學致癌物不可缺少的一部分，並在危險性評價中起著很重要的作用。大鼠肝細胞取材方便，成活率高。大鼠肝細胞本身的S期DNA合成水平很低，而且肝細胞又含有代謝所需要的大部分促進活化的廣譜酶系，本身含S₉活化系統，較接近體內的環境，是活化、吸收、分解毒物的重要代謝細胞。

　　致癌過程的體細胞突變理論，最早是由Bauer提出^﹝7﹞。致突變與致癌性之間具有良好的相關性。腫瘤細胞的形成主要由于正常細胞發生基因及外基因的改變而引起。癌基因的激活可以是基因水平的，也可是外基因水平或兩者兼而有之，其結果是造成基因定量或定位上的差別，從而使正常的表型轉化為癌細胞表型。另一方面，抑制癌瘤發生的抑癌基因由于某種原因功能喪失，使細胞癌變失去控制，如P53基因、rb-1基因^﹝8～10﹞。腫瘤發生的過程是多階段、多因素、多途徑總和作用的結果，腫瘤發生的每一步都反應出不同基因的喪失、激活和突變^﹝11﹞。

　　腫瘤的發生過程相當復雜，多半不是由單一的環境因素所決定，而可能是多種因素相互作用或共同作用的結果。1984年Upton/Weisburger和Williams分別提出按外源性化學物質致癌的可能機理將化學物分為3類，即遺傳毒性致癌物(genotoxic)、可能的間接遺傳毒性致癌物(indirectly genotoxic)、以及非遺傳毒性致癌物(non-genotoxic)。本次研究發現AFB₁與DON具有致突變、誘導S期合成作用，同時兩者還具有交互作用。其原因可能是AFB₁與DON在腫瘤的發生中既以遺傳毒性物質的形式發揮作用，又以非遺傳毒性物質的形式在腫瘤的發生中共同發揮作用。有研究表明，在霉變的糧食中含有促進AFB₁致突變和/或致癌的物質。由于致癌性與致突變性之間高度相關^{﹝12，13﹞}，這種協同效應的存在可能是增加居民患腫瘤的危險因素之一。故對霉菌毒素間的交互作用問題應引起重視。

　　作者簡介：劉曉清，女，主治醫師，碩士生

　　1 中國預防醫學科學院環境衛生監測所

　　2 北京結核病防治研究所內科

　　作者簡介：李斌，男，碩士，助教李斌（上海醫科大學營養與食品衛生學教研室，上海　200032）　郭紅衛（上海醫科大學營養與食品衛生學教研室，上海　200032）

　　4　參考文獻

　　1，Uno Y, Takasawa H, Miyagawa M, et al. An in vivo-in vitro replicativ e DNA synthesis(RDS) test using rat hepatocytes as an early prediction assay for nongenotoxic hepatocarcinogens screening of 22 known positives and 25 noncarcinogens. Mut Res,1994,320:189

　　2，Wang DS, Liang YX, Chan NT, et al. Natural co-occurrence of Fusarium toxins and aflatoxin B1 in corn for feed in north vietnam. Natural Toxins,1995,396:145

　　3，Akihiro Y, Yoshizawa T, Aiura Y, et al. Fusarim mycotoxin (fumonisins, nivalenol and zearalenol) and Aflatoxin in corn from southeast Asia. Bios Biot bioc,1995,59(9):1804

　　4，廣西醫學院腫瘤研究小組.肝癌高發區食物的誘癌實驗.腫瘤防治研究，1975，2：13

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　　6，金丕煥主編.醫學統計方法.上海：上海醫科大學出版社，1993，85

　　7，Burdette WJ. The significance of mutation in relation to the origin of tumors:a review. Cancer Res,1955,15:201

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　　9，朱明華，王文亮.腫瘤抑制基因P53突變與原發性肝癌的關系.中華腫瘤雜志，1993，15(1)：245

　　10，朱明華，Feitelson MA, London WT.HBxAg和P53蛋白結合在原發性肝癌發生中的意義.中華醫學雜志，1993，73(6)：325

　　11，餘新生，徐雪芳，何方法，等.肝癌高發家族對黃曲霉毒素B1的易感性.腫瘤，1981，1(1)：11

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　　13，Maron DN, Ames BN. Revised method for the salmolla mutagenicity test. Mut at Res,1983,113:173