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肺腺癌及肺鱗癌MRP-mRNA的表達及臨床意義
軍醫進修學院學報2000年第21卷第1期
楊俊蘭 石廷章 魏秀芳
摘 要：目的：觀察 30例肺癌組織及癌旁肺組織MRP的表達。方法：RT-PCR方法。結果：43.33%的肺癌組織表達MRP，且MRP的表達與細胞分化程度有關，低分化者MRP的表達明顯高于中高分化者(P＜0.05)。腺癌的表達(62.5%)高于鱗癌(21.43%，P＝0.058)。MRP的表達與臨床分期無關(P＝0.511)。結論：43.33%的肺癌組織表達MRP，MRP的表達可能與肺癌的耐藥有關。
關鍵詞：多藥耐藥相關蛋白；肺腺癌；肺鱗癌
多藥耐藥相關蛋白(MRP)是近年發現的一種與腫瘤多藥耐藥有關的糖蛋白，文獻報道MRP表達與腫瘤的分化、分期及預後有關。目前國內尚未見有關肺癌組織MRP的研究。作者檢測了30例肺癌組織及肺正常組織MRP的表達情況，報告如下。
1 材料和方法
1.1 臨床資料 30例肺癌標本均為外科肺癌手術患者，每例患者均同時取距癌腫≧3cm的肺組織，手術後立即取材並儲存于液氮罐中。30例患者中：男性24例、女性6例。年齡範圍：35～68歲，平均年齡55.31歲；其中：鱗癌14例、腺癌16例。根據腫瘤的分級標準﹝1﹞，14例鱗癌中：中～高分化者8例，低分化者6例；16例腺癌中：中～高分化者9例，低分化者7例。所有患者術前均未進行任何抗腫瘤治療。
1.2 MRP引物序列
5′ACACTCCACAGATCACTC3′
5′CATGGTGCAGGGTCTACG3′
擴增片段為290bp
1.3 步驟
1.3.1 總RNA提取 取新鮮組織2～3mg，搗碎後，置樣品管中，加入200μl裂解液，充分震蕩，使沉澱完全溶解，加入40μl氯仿混勻，12000r/min離心5min，小心吸取上層水相，加3倍體積無水乙醇，-20℃放置20min，12000r/min離心5min，棄上清，室溫晾幹約20min，即可得到標本的總RNA。
1.3.2 RNA-cDNA反轉錄 向處理好的樣品中加入15μl逆轉錄液、1μl酶混合液，離心數秒，42℃水浴30min。
1.3.3 PCR擴增 以MRP陽性模板作為陽性對照，以DEPC水代替cDNA作為陰性對照。取反轉錄產物、陽性對照及陰性對照各5μl，分別加入20μlPCR液、1μlTaq酶，一滴石蠟油，離心數秒，按下述條件擴增35個循環：
94℃45s 55℃45s 72℃45s
1.3.4 電泳鑑定 含EB的2%瓊脂糖配制：100mlTBE(Tris-硼酸)+2g瓊脂糖+5μlEB
用10μlPCR產物、2μl上樣緩衝液混勻後點樣，恆壓5V/cm，電泳時間為溴酚藍染料走至1/3～1/2膠長處。
1.4 結果記錄及判斷 陽性結果為兩條帶，分別為：MRP帶(290bp)，β2微球蛋白帶(430bp)。陰性結果為一條帶，為β2微球蛋白帶(430bp)。
1.5 統計學處理採用校正卡方檢驗。
2 結 果
30例肺癌組織中，MRP-mRNA表達陽性者13例，其中：鱗癌3例、腺癌10例；癌旁肺組織中，MRP-mRNA表達陽性者8例，其中：鱗癌2例、腺癌6例(表1)。
表1 肺癌組織及相應癌旁肺組織MRP-mRNA表達(n=30)
| |
MRP-mRNA陽性(%) |
MRP-mRNA陰性(%) |
| 肺癌組織 |
13(43.3) |
17(56.7) |
| 癌旁肺組織 |
8(26.7) |
22(73.3) |
|
MRP的表達與臨床分期無明顯關系(P＝0.511)，與癌細胞的分化程度有關(P＝0.03)。病理類型顯示：MRP在腺癌的表達(62.5%)高于鱗癌(21.43%)，P值未見顯著性差異可能與例數較少有關(表2)。
表2 不同病理特征患者MRP-mRNA表達 |
| 病理特征 |
例數 |
MRP-mRNA |
陽性率(%) |
P |
| (+) |
(-) |
| 病理類型 |
|
|
|
|
|
| 鱗 癌 |
14 |
3 |
11 |
21.43 |
|
| 腺 癌 |
16 |
10 |
6 |
62.5 |
0.058 |
| 病理分期 |
|
|
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|
| Ⅰ |
1 |
0 |
1 |
0.00 |
|
| Ⅱ |
20 |
8 |
12 |
40.00 |
|
| Ⅲ |
8 |
4 |
4 |
50.00 |
|
| Ⅳ |
1 |
1 |
0 |
100.00 |
0.511 |
| 組織分化 |
13 |
9 |
4 |
69.23 |
|
| 低分化 |
|
|
|
|
|
| 中高分化 |
17 |
4 |
13 |
23.53 |
0.03 |
3 討 論 肺癌的耐藥性有多種機制，MDR1是近10年來研究較多的一種耐藥機制，隨著研究的深入，人們發現MDR1的表達不足以解釋非小細胞肺癌的多藥耐藥，而且在一些耐藥的肺癌中也未發現P-gp的過度表達。自1992年Cole發現多藥耐藥相關蛋白(MRP)後，研究MRP與肺癌多藥耐藥的關系成為人們關注的熱點，MRP基因位于16號染色體P13.1帶上，由2.8kb堿基組成，該基因編碼1531個氨基酸組成的蛋白質，其分子量為190ku堿基組成，該基因編碼1531個氨基酸組成的蛋白質，其分子量為190ku，其多藥耐藥作用與P-gp的表達無關，而與細胞內MRP的藥物泵作用及其引起細胞內藥物濃度降低有關﹝2﹞，MRP的耐藥譜與MDR1相仿。國外研究表明：MRP基因的表達與肺癌的分期、分化及預後有關﹝3～5﹞，也有研究認為：MRP在肺癌耐藥中的作用有可能大于MDR1﹝6﹞。筆者檢測了肺癌及肺正常組織MRP基因的表達情況結果表明：43.33%的肺癌組織有MRP-mRNA表達，從癌細胞分化程度可以看出：低分化者MRP-mRNA的表達(69.23%)明顯高于中高分化者(23.53%，P＜0.05)，說明MRP的表達與細胞分化程度相關。本研究30例患者中，肺腺癌16例，有10例患者表達MRP，佔62.5%，這與臨床上肺腺癌對化療不敏感是一致的。本研究的所有患者術前均未行任何化療，說明MRP的表達為先天性。■
作者簡介：楊俊蘭，女，1964-01-06生，山西省臨猗縣人，1985年山西醫學院畢業，1993年軍醫進修學院碩士畢業，解放軍總醫院腫瘤內科副主任醫師；發表論文10篇。電話：(010)66937098
作者單位：楊俊蘭（解放軍總醫院腫瘤科，北京 100853）
石廷章（解放軍總醫院腫瘤科，北京 100853）
魏秀芳（解放軍總醫院腫瘤科，北京 100853）
參考文獻：
﹝1﹞俞孝庭.腫瘤病理學﹝M﹞.上海：科學技術出版社，1986.
﹝2﹞Grant CE, valdimarson G, Hipfner DR et al. Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs ﹝J﹞. Cancer Res, 1994,54:357-360.
﹝3﹞Higashiyama M, Doi O, Kodama K et al. Immunohistochemically detected expression of motitity-related protein-1 (MRP-1/CD9) in lung adenocarcinoma and it′s relation to prognosis﹝J﹞. Int J Cancer, 1997,74(2):205-210.
﹝4﹞Ota E, Abe Y, Oshika Y et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in non-small-cell lung cancer ﹝J﹞. br J Cancer, 1995,72(3):550-554.
﹝5﹞Nooter K, Bosman F T, Burger H, et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in primary non-small-cell lung cancer﹝J﹞. Ann Oncol, 1996,7(1):75-79.
﹝6﹞Narasaki F, Matsuo I, Ikuno N et al. Multidrug resistance-associated protein (MRP) gene expression in human lung cancer. Anticancer Res ﹝J﹞,1996,16(4A):2079-2084.
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