癌基因MDM2過度表達與兒童急性淋巴細胞白血病的發病和預後的關系

　　中華兒科雜志2000年第38卷第7期

蔣莎義　陳力軍　高飛　李桂梅　劉廷亮　尹洪臣

　　關鍵詞：MDM2；兒童；急性淋巴細胞白血病；發病；預後

　　MDM2是抑癌基因p53的拮抗基因。p53基因突變發生于人類許多腫瘤，所以被認為與這些腫瘤的發生有關，而在白血病中p53基因突變則少見，卻有P53蛋白功能的失活^﹝1,2﹞。MDM2過度表達是p53基因突變以外的另一p53基因失活途徑。我們用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測了兒童急性淋巴細胞白血病（ALL）治療前外週血單個核細胞中MDM2 mRNA表達情況，並分析MDM2過度表達與兒童ALL發病及預後的關系。

　　對象

　　1997年3月～1998年10月收治初發兒童ALL 32例，其中男23例，女9例；年齡1.5～11歲，平均年齡6.6歲。初診時外週血幼稚細胞在60%以上。每例治療前抽取外週血5 ml，淋巴細胞提取液提取單個核細胞，置-80℃儲存備用。同時收集22例健康兒童外週血，提取單個核細胞作為對照。

　　方法

　　MDM2引物有意義鏈：5′-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3′，反意義鏈：5′-TGAAGGTTTCTCTTTCCTGAAG-3′;β-actin引物有意義鏈：5′-AAGGATTCCTATGTGGGC-3′,反意義鏈：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。TRIZOL試劑提取單個核細胞內總RNA。

　　MDM2、β-actin cDNA的合成：取樣本所提的RNA 2 μg，加MDM2(或β-actin) 反意義鏈引物，AMV逆轉錄酶等。反應體系總量25 μl，終濃度為dNTP0.5 mmol/L，Mg⁺⁺ 10 mmol/ L，KCl 50 mmol/ L，Tris 50 mmol/ L，42℃水浴1 h，95℃ 5 min滅活AMV酶。

　　PCR擴增MDM2、β-actin cDNA：取上述逆轉錄產物5 μl，加入MDM2(或β-actin)有意義鏈和反意鏈引物、 taq酶等，總反應體系50 μl，終濃度dNTP 200 mmol/ L，Mg⁺⁺200 mmol/ L, KCl 50 mmol/ L，Tris 18 mmol/ L。擴增30個循環，每個循環94℃30 s變性，56℃ 30 s退火，72℃ 60 s延伸。

　　電泳及掃描分析：2% 的瓊脂糖凝膠，電泳上述PCR產物2 h，紫外燈下攝像。島津薄層光密度掃描儀分別測MDM2和β-actin擴增產物電泳帶強度的積分值，記錄各樣本兩者積分值之比。χ²檢驗及四格表確切概率法對結果進行統計學分析。

　　結果

　　根據Buteso-Ramos等^﹝3﹞的判斷方法，我們將MDM2與β-actin之比＞20%定為過度表達。本組兒童急性淋巴細胞白血病MDM2 mRNA過度表達率為44%（14/32），患兒組MDM2 mRNA表達明顯高于對照組（0/22），差異有顯著性(P＜0.01)。

　　對接受治療的25例患兒隨訪半年以上，根據對化療的反應及復發情況，將25例患兒進行分組。不良預後組6例：2例于誘導緩解期死于顱內出血，2例用VDLP方案化療4週，骨髓呈部分緩解，2例誘導緩解後半年內復發；一般預後組19例，持續緩解半年以上。不良預後組MDM2 mRNA過度表達率 (5/6)與一般預後組（5/19）比較，差異有顯著性（P=0.0225）。

　　討論

　　野生型P53蛋白有抑制細胞過度生長，誘導細胞凋亡的作用。MDM2編碼蛋白P90能與P53蛋白結合，抑制其功能。目前認為MDM2過度表達是白血病發生的重要環節。高產量的MDM2蛋白抑制了P53蛋白對細胞過度生長的抑制作用，阻止P53蛋白介導的凋亡，在腫瘤的發生中起重要作用。在多數人類肉瘤中，MDM2高表達方式是基因擴增，而在白血病中 mDM2 基因擴增卻不常見。我們的研究結果提示，在兒童ALL的發病中是MDM2 mRNA過度表達而非DNA擴增。

　　研究表明，MDM2 mRNA過度表達與兒童ALL的不良預後有關。隨著白血病治療方法的進展，目前70%～75%的兒童ALL已達長期無病生存。但仍有少數患兒對化療不敏感和易復發，需要早期決定是否使用更有效的治療手段，如骨髓移植。分子生物學方法在兒童ALL研究中的應用將使我們為臨床估計ALL患兒預後、選擇有效的治療方案提供可靠依據。

　　作者單位：蔣莎義(250021　濟南,山東省立醫院兒科)

　　陳力軍(250021　濟南, 山東省立醫院兒科)

　　高飛(250021　濟南, 山東省立醫院兒科)

　　李桂梅(250021　濟南, 山東省立醫院兒科)

　　劉廷亮(250021　濟南, 山東省立醫院兒科)

　　尹洪臣(250021　濟南, 山東省立醫院兒科)

　　參考文獻

　　1，Seliger B, Papadileris S, vogel U, et al. Analysis of the p53 and MDM2 gene in acute myeloid leukemia. Eur j Haematol, 1996, 57: 230-240.

　　2，Marks DI, Kurz BE, Link MP, et al. High incidence of potential p53 inactivation in poor outcome childhood acute leukemia at diagnosis. Blood, 1996,87: 1155-1161.

　　3，Bueso-Ramos CE, Yang Y, Deleon E，et al. The human MDM2 oncogene is overexpressed in leukemias. Blood, 1993,82:2617-2623.