蓖麻毒素毒性作用機理研究進展

　　中華預防醫學雜志

　　1999年第1期No.1 1999

趙英

　　關鍵詞：蓖麻毒素 誘導 靶細胞 凋亡

　　蓖麻毒素作為免疫毒素中最常應用的毒素之一伴隨著腫瘤導向治療的研究受到了國內外的重視，對其毒性作用的認識也不斷深化。以往認為蓖麻毒素僅是單一的蛋白質合成抑制劑，近幾年研究發現，除此之外它還具有誘導產生細胞因子，引起脂質過氧化及誘導細胞凋亡的作用。

　　一、蓖麻毒素的結構特點

　　蓖麻毒素是從蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64 000。毒素由A和B兩條多肽鏈組成，兩鏈間由一個二硫鍵連接。目前，A鏈和B鏈的氨基酸序列以及二級結構已基本清楚。毒素B鏈上含有兩個半乳糖或半乳糖殘基結合位點，可和細胞表面的含半乳糖殘基的受體結合，通過內陷作用進入細胞質，發揮毒性作用。蓖麻毒素A、B鏈上還分別含有1和2個糖支鏈，鏈末端均為甘露糖殘基^﹝1﹞，可以和網狀內皮細胞特別是巨噬細胞結合。後者細胞表面富含甘露糖受體，可優先攝取蓖麻毒素，這對于毒素發揮生物功能有重要的作用。

　　二、蓖麻毒素毒性作用機理

　　1.抑制蛋白質合成：蓖麻毒素具有強烈的細胞毒性，屬于蛋白合成抑制劑或核糖體失活劑，這也是在構建免疫毒素時，應用到蓖麻毒素的主要原因。毒素抑制蛋白合成的機理在70年代已經明確，以後略有補充^﹝2，3﹞。首先，毒素依靠B鏈上的半乳糖結合位點與細胞表面含末端半乳糖殘基的受體結合，促進整個毒素分子以內陷方式進入細胞，形成細胞內囊，毒素從細胞內囊中進入細胞質，隨後蛋白鏈間二硫鍵被還原裂解，遊離出A鏈。A鏈是一種蛋白酶，作用于真核細胞核糖體60S大亞單位的28S rRNA，水解A4324位點的腺嘌呤N-糖甙甙鍵，使其脫去腺嘌呤，喪失抗RNA酶的抗性而被降解，不能與延長因子(EF-2)結合，從而幹擾了核糖體，EF-2，鳥嘌呤三磷酸腺苷(GTP)復合體的形成，導致蛋白質合成的抑制，最終細胞死亡。已引起研究者注意的是：① B鏈對A鏈發揮毒性具有重要的促進作用。② 在細胞內鏈間二硫鍵的還原裂解對毒素發揮毒性作用具有重要作用。③ 最新的研究表明：B鏈上的半乳糖結合位點也參與了毒素的體內毒性^﹝4﹞。

　　2.誘導細胞因子的損傷作用：蓖麻毒素中毒損傷的許多症狀，不能完全由抑制蛋白質合成來解釋，促使學者探討其新的毒性作用機理。1986年，Tracey等^﹝5﹞發現蓖麻毒素中毒大鼠的腸道損傷類似TNF/Chchectin處理的大鼠腸道。1991年Nadkami和Deshphude認為蓖麻毒素中毒後的許多現象，例如：發熱，肝出血性壞死，腹水，胸水的滲出，腸道的出血壞死性炎症等等早期的急性反應都與腫瘤壞死因子(TNF-α)，白細胞介素(IL-1)，IL-6的分泌有關。1993年，Licastro等^﹝6﹞檢測到蓖麻毒素誘導體外培養的外週血單核細胞分泌TNF-α和IL-1β，同時在蓖麻毒素中毒大鼠的血漿中亦可檢測到低水平的TNF-α。1994年Mudlooon等^﹝7﹞發現，體內注射抗TNF的抗體，將明顯降低蓖麻毒素對小鼠的氧化損傷。1997年，董巨瑩等^﹝8﹞亦報道了TNF在蓖麻毒素中毒小鼠肝髒的免疫組織化學定位。細胞因子參與機體損傷的另一個例子是：對于由蓖麻毒素構建的免疫毒素1，2期臨床試驗中病人出現的副作用：包括發熱、肌痛、毛細血管滲漏綜合症等可以通過封閉或拮抗這些細胞因子的功能而減輕^﹝6﹞。

　　蓖麻毒素誘導細胞因子的機理目前多數認為是通過刺激淋巴樣細胞產生的。主要為巨噬細胞和肝Kupffer′s細胞。這些細胞表面含有甘露糖受體，可與蓖麻毒素分子中3個末端甘露糖殘基特異結合而優先被攝取。蓖麻毒素誘導細胞因子的分泌有劑量和時間依賴性。毒素是否可誘導其他細胞因子的產生以及各細胞因子之間是否具有網絡免疫調節的作用，尚待探討。

　　3.脂質過氧化損傷作用：蓖麻毒素與巨噬細胞的相互作用，不僅誘導細胞免疫，而且誘導產生自由基和活性氧，引起脂質過氧化作用。1991年，Muldoon和Stohes^﹝9﹞發現蓖麻毒素可以誘導小鼠體內的脂質過氧化作用，結果導致尿液中丙二醛、甲醛、丙酮的含量增加。1992年的研究表明^﹝10﹞，各髒器中脂質過氧化強度(MDA含量)，還原型谷胱甘肽的減少以及DNA單鏈斷裂程度在毒素中毒36小時後最為強烈，且肝髒的損傷最為嚴重。結合以往的研究^﹝11﹞：谷胱甘肽的使用可以部分對抗致死劑量的毒素效應，具有潛在的化學保護作用，因此，Muldoon等^﹝10﹞認為蓖麻毒素引起的氧化作用可以歸屬到蓖麻毒素的毒性機理中去。

　　許多毒物可以通過激活巨噬細胞分泌ROS(reactive oxygen species)和TNF誘發氧化作用。已有的研究表明^﹝7，12﹞：TNF-α抗體，鐵離子對蓖麻毒素誘導的脂質過氧化和氧化損傷起重要的調節作用。給小鼠注射抗TNF-α的抗體，可以明顯降低尿液丙二醛，甲醛，丙酮的含量。鐵離子以及去鐵敏(desferrioxamine)的摻入，可分別增加和減少蓖麻毒素誘導的脂質過氧化的水平。蓖麻毒素引起體內氧化損傷的機理還待更深入的探討。

　　4.蓖麻毒素誘導細胞凋亡：壞死和凋亡是細胞死亡的兩種方式。在引起細胞凋亡的三大類因素中，毒素，抗癌藥物是其中之一。以往認為化療藥物是通過引起靶細胞發生不可逆代謝障礙而殺死腫瘤細胞，近年來認為是通過改變生理環境而誘發細胞發生PCD(programmed cell death)而達到療效。1989年，Leek等^﹝13﹞報道：在蓖麻毒素中毒的腸道病理研究中利用免疫組織化學和電子顯微鏡觀察到腸道上皮細胞的胞漿中存在凋亡樣的變化。1990年，Waring報道^﹝14﹞；蓖麻毒素可誘導巨噬細胞，未成熟T細胞出現DNA破碎(DNA fragmentation)，而後者被認為是與凋亡有關的生化改變之一。1991年，他們報道了蓖麻毒素誘導上皮樣細胞發生凋亡樣的形態學改變。1996年，Fu等^﹝4﹞報道了蓖麻毒素可誘導小鼠體內甲狀腺，脾髒的細胞出現凋亡現象。

　　凋亡的發生與一些凋亡相關基因的開放和凋亡蛋白表達的調節有關。蓖麻毒素作為蛋白合成抑制劑又如何誘導細胞發生凋亡呢?兩者是否矛盾呢?已有的實驗證實^﹝14﹞：蓖麻毒素等蛋白質合成抑制劑誘導細胞凋亡的機制與它們抑制蛋白合成作用無關，亦不需要Ca²⁺依賴性核酸內切酶的參與，而是與其升高細胞內的三磷酸肌醇水平有關。另外，有報道^﹝15﹞：巨噬細胞的粘附可以阻止蓖麻毒素誘導的巨噬細胞凋亡現象的發生。蓖麻毒素的抗吞噬細胞作用可能直接導致DNA斷裂和誘導細胞凋亡。資料表明：引起細胞壞死的有害因素在強度很大時可導致細胞壞死，但強度較小時卻引起細胞發生凋亡^﹝16﹞。蓖麻毒素誘導的細胞凋亡也存在明顯的劑量依賴性^﹝15﹞。總之，蓖麻毒素誘導細胞發生凋亡與傳統的蓖麻毒素作為蛋白質合成抑制劑並不構成矛盾，有可能對現有的凋亡理論是一種非常關鍵的補充和完善。

　　三、總結和展望

　　蓖麻毒素的毒性具有明顯的劑量依賴性，毒素誘導細胞因子的產生，引起體內脂質過氧化損傷以及誘導靶細胞凋亡等等都是在小劑量範圍內具有的，而大劑量的蓖麻毒素仍主要表現為抑制蛋白質合成的毒性。毒素誘導細胞因子的產生及引起體內脂質過氧化損傷的作用，均與其糖鏈末端甘露糖殘基被巨噬細胞特異性攝取，並激活巨噬細胞有關，是毒素損傷的繼發作用。蓖麻毒素等蛋白質合成抑制劑誘導凋亡的理論研究對現有的凋亡理論可能會有重要的補充價值。

　　蓖麻毒素的毒性作用機理研究，特別是近幾年的研究進展，豐富了人們對蓖麻毒素毒性作用的認識，為蓖麻毒素抗癌研究進一步提供了理論依據和新的思路。

　　本課題受國家自然科學基金資助(編號：39500122)

　　作者單位：710032 西安市 第四軍醫大學毒理學教研室

《參考文獻》

　　[1]　David NS, Brian MJF. Elective uptake of ricin A-chain by hepatic non-parenchymal cells in vitro, importance of mannose oligosaccharides in the toxin. FEBS, 1986, 196：3367.

　　[2]　Sjur OS, Refsnes K, Pihl A, et al. Mechanism of action of the toxic lectins abrin and ricin. Nature, 1974, 249：627-631.

　　[3]　Yaeta E, Kazuhiro M, Mitsuyoshi M, et al. The mechanism of action of ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes. J Bioll Chem, 1987, 262：5908.

　　[4]　Fu T, Burbage C, Tagge Ep, et al. Ricin toxin contains three lectin sites which contribute to its in vivo toxicity. Int J Immunopharmacol, 1996, 18：685-692.

　　[5]　Tracey KJ, Beutler B, Lowry SF, et al. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachetin. Science, 234:470-474.

　　[6]　Licastro F, Morini MC, Bolognesi A, et al. Ricin induced the production of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta by human peripheral-blood mononuclear cells. Biochem J, 1993, 294(Pt2)：517-520.

　　[7]　Muldoon DF, Bagchi D, Hassoun EA, et al. The modulating effects of tumor necrosis factor alpha antibody on ricin-induced oxidative stress in mice. J Biochem Toxicol, 1994, 9：311-318.

　　[8]　董巨瑩，王劍波，王文學.蓖麻毒素誘導小鼠肝髒產生腫瘤壞死因子.第四軍醫大學學報，1997，18：78.

　　[9]　Muldoon DF, Stohes SJ. Ricin-induced oxidative stress in mice. Toxicologist, 1991, 11：214.

　　[10]　Muldoon DF, Hassoun EA, Stohs SJ. Ricin-induced hepatic lipid peroxidation, glutathione depletion and DNA single-strand breaks in mice. Toxicon, 1992, 30：977-984.

　　[11]　Corwin AH. Toxic constituents of the castor bean. J Med Pharm Chem, 1961, 4：483-496.

　　[12]　Muldoon DF, Hassoun EA, Stohes SJ. Role of iron in ricin-induced lipid peroxidation and superoxide production. Res Commun Mol Pathol Pharmacol, 1996, 92：107-118.

　　[13]　Leek MD, Griffiths GD, Green MA. Intestinal pathology following intramuscular ricin poisoning. J Pathol, 1989, 159：329-334.

　　[14]　Waring P. DNA fragmentation induced in macrophages by gliotoxin does not require protein synthesis and is preceded raised inositol triphosphate levels. J Biol Chem, 1990,, 265：14476-14480.

　　[15]　Khan T, Waring P. Macrophage adherence prevents apoptosis induced by ricin. Eur J Cell Biol, 1993, 62：406-414.

　　[16]　江渝.程序型細胞死亡的生物化學基礎.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，1996，17：178-182.

(收稿：1998-01-06　修回：1998-04-29)

(本文編輯：劉群)