p53基因突變與EB病毒相關性鼻咽部T細胞淋巴瘤

　　中國腫瘤臨床1999年第26卷第6期

高子芬　姜芬　潘增剛　王洪海　田君才

　　 摘　要　目的：了解p53基因突變與埃伯斯坦－巴爾病毒（EBV）相關性鼻咽部T細胞淋巴瘤（NPT）的關系。方法：應用免疫組織化學方法（SABC），原位雜交（ISH），PCR－SSCP對26例確診為鼻咽部T細胞淋巴瘤的病例進行p53蛋白及基因的檢測。結果：EBV編碼的小RNA探針（EBER）17/26例陽性（65.4％）；p53蛋白13/26例陽性（50％）；對其中12例進行p53外顯子5，7，8的PCR－SSCP檢測，發現p53突變7/12例(58.3％)陽性，EBV陽性組5/8例陽性（62.5％），陰性組2/4例（50％）陽性，外顯子5突變4/12例(33.3％)陽性，外顯子7突變1/12例(8.3％)陽性，外顯子8突變3/12例(25％)陽性，其中1例同時發生5，8兩個外顯子突變；EBER/p53蛋白表達同時發生有11例，不發生7例，EBER＋/p53－6例，EBER－/p53＋2例；EBER表達（ISH）與p53基因突變（PCR－SSCP）同時發生5例，不發生2例，EBER＋/p53－(PCR－SSCP)3例，EBER－/p53＋(PCR－SSCP)2例；以p53蛋白檢測為標準，p53基因突變（PCR－SSCP）與p53蛋白表達（SABC）符合率83％，敏感率為85.7％，假陰性率20％。結論：鼻咽部T細胞淋巴瘤（NPT）EBV感染與p53基因突變無明顯相關性。

　　關鍵詞：EBV　p53　EBER　鼻咽部　T細胞淋巴瘤

　　鼻咽部T細胞淋巴瘤與EB病毒相關性近年研究活躍^[1～3]，主要集中于EBV的檢出，流行病學的調查，但對癌基因方面的研究較少。作者在多年對鼻咽部淋巴瘤病因發病研究的基礎上，進行EBV相關性鼻咽部T細胞淋巴瘤p53基因突變的研究，探討EBV感染後p53基因突變的情況及與p53蛋白表達的關系。

　　1　材料與方法

　　1.1　材料

　　26例鼻咽部T細胞淋巴瘤選自北京醫科大學病理學系及空軍總醫院外檢檔案及會診材料，其中鼻腔13例，鼻咽8例，咽部5例。除1例女性外均為男性。年齡18～99歲，平均47.21歲。所有標本經10％福爾馬林固定，石蠟包埋及HE染色。

　　1.2　免疫組化

　　方法為標準SABC法，鼠抗人p53單克隆抗體（DO－7）購自DAKO公司。切片經脫蠟到水，微波抗原修復（700W5分鐘×2次，自然冷卻至室溫）。一抗4℃過夜，DAB顯色。陽性對照為已知p53陽性的乳腺癌病例。

　　1.3　原位雜交

　　探針選用EBV編碼的小mRNA(EBER,DAKOY017)。主要步驟：1)石蠟切片脫蠟到水；2)蛋白酶K消化（4mg/L,37℃,30分鐘），酒精脫水，空氣幹燥；3)滴加熒光素標記的EBER探針（EBER－FITC)5μl，加硅化蓋玻片，37℃，雜交2小時；4)Triton－x100洗，滴加堿性磷酸酶（AP）標記的抗熒光素抗體（DAKOK046)1:50,30分鐘；5)底物緩衝液孵育，BCIP/NBT顯色；6)甲基綠復染。陽性對照為已知EBER陽性的霍奇金病例。陰性對照組為TBS替代EBV探針。

　　1.4　PCR

　　主要步驟：1)切5μm厚10片石蠟包埋組織，二甲苯脫蠟2小時×3次，無水乙醇30分鐘×3次；2)400μl Lysis buffer,8μl20mg/ml蛋白酶K消化（55℃至組織消化完全）；3)酚氯仿（1:1）抽提蛋白質；4)1/5體積3MNAAC(pH5.2)二倍體積無水乙醇，－20℃過夜，沉澱DNA；5)三蒸水溶解DNA，測OD值了解DNA濃度。

　　反應體系：25UL體系,DNA模板1μg，上下遊引物各0.5μl(25mmol/L)，dNTP(4mmol/L)1μl,10×buffer2.5μl,Taq酶0.1μl,ddH2O19.9μl。

　　反應條件：水浴PCR儀94℃45秒,56℃45秒,72℃45秒,35個循環，72℃5分鐘。

　　電泳：50V,1.5％瓊脂糖。

　　1.5　SSCP

　　1)配膠30％Acr－bis(59:1)5.3ml,ddH2O10.5ml,5×TBE4ml,10％AP130μl,TEMED10μl;2)變性：5μlPCR產物與5μl loading buffer(95％去離子甲酰胺，10mmol/LEDTApH8.0,0.05％溴酚藍，0.05％二甲苯氰藍）混勻，95℃10分鐘，冰浴5～7分鐘；3)電泳：恆壓50V，恆溫15℃12小時；4)固定，染色，顯色，終止，封膠分析結果。每次電泳都以正常DNA擴增產物做陽性對照，若樣品電泳條帶比正常增多，減少或位置變動，即為突變。

　　2　結果

　　2.1　p53蛋白表達（SABC）

　　陽性信號主要位于腫瘤細胞核內（圖1），同時有些瘤細胞胞漿內亦可見p53蛋白表達。13/26例(50％)陽性，表達程度可分三級，＋:視野內陽性細胞10％～30％，著色較弱；＋＋:視野內陽性細胞30％～60％，著色較深；＋＋＋:視野內陽性細胞60％，和（或）著色很深。＋:5/26例，＋＋:4/26例，＋＋＋:4/26例。

圖1　p53蛋白免疫組化結果。陽性信號位于細胞核內，呈粗棕黃色顆粒。SABC法DAB　×200

　　2.2　EBER表達（ISH）

　　EBV－EBER陽性信號位于瘤細胞胞核上，呈深藍紫色（圖2）。陽性17/26例(65.4％)。根據陽性細胞佔整個視野內腫瘤細胞百分比定量分析，結果在10％～90％之間。

圖2　EBV－EBER原位雜交結果。陽性信號位于細胞核內，呈藍紫色顆粒。ISHBCIP/NBT　×100

　　2.3　p53突變（PCR－SSCP）

　　對其中的12例進行了p53突變的檢測，7/12例(58.3％)陽性，外顯子5突變4/12例(33.3％)陽性，外顯子7突變1/12例(8.3％)陽性，外顯子8突變3/12例(25％)陽性，其中1例同時發生5,8外顯子突變（圖3,4）。

圖3　PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果M:marker,

　　1:exon5 181bp,2:exon7 171bp,3:exon8 204bp

圖4　PCR－SSCP結果N為正常對照。T1為腫瘤，呈泳動變位，T2為腫瘤，條帶增加

　　2.4　EBER表達（ISH）與p53蛋白表達（SABC）相關性

　　二者同時表達有11例，皆不表達有7例；EBER＋/p53－6例，EBER－/p53＋2例。統計學分析EBER表達（ISH）與p53蛋白表達（SABC）缺乏相關性，見表1。

表1　EBV感染與p53蛋白表達的關系

　χ2=0.40　＜37.65　P＞0.05

　　2.5　EBER表達（ISH）與p53基因突變（PCR－SSCP）相關性

　　二者同時發生有5例，皆不發生有2例，EBER＋/p53－(PCR－SSCP)3例，EBER－/p53＋(PCR－SSCP)2例。統計學分析EBER表達（ISH）與p53基因突變（PCR－SSCP）缺乏相關性，見表2。

表2　EBV感染與p53基因突變的關系

χ2=0.04　＜3.84　P＞0.05

　　2.6　p53基因突變（PCR－SSCP）與p53蛋白表達（SABC）

　　發生p53基因突變和蛋白表達各有6例，皆不發生有4例。p53＋(SABC)/p53－(PCR－SSCP)1例，p53(SABC)/p53＋(PCR－SSCP)1例，PCR－SSCP方法與免疫組化符合率83％，PCR－SSCP敏感率85.7％，假陰性率20％，見表3。

表3　PCR－SSCP檢測p53第5～8外顯子突變結果與免疫組化染色結果比較

　　3　討論

　　3.1　p53突變與EBV感染的關系

　　野生型p53蛋白是一種核轉錄因子，參與細胞週期調控。其生物學功能：1)誘導細胞生長停滯于G1期；2)DNA損傷後誘導調亡^[4,5]；3)抑制腫瘤細胞生長；4)保護遺傳穩定性^[6]。野生型p53蛋白半衰期很短，正常細胞含量低，免疫組化方法不能檢出。當p53基因突變時，半衰期延長，可用免疫組化方法檢出。在多種人惡性腫瘤中p53發生突變或缺失^[7～12]。近年研究表明，一些病毒蛋白LMP－1和細胞蛋白MDM－2可與野生型p53蛋白結合，使其穩定性增加，半衰期延長，亦可用免疫組化方法檢出^[13～15]。此外，p53協同基因p33缺失，p53蛋白核定位信號缺失也可導致p53蛋白在核內的堆積。因此，p53蛋白陽性反映兩種情況：一是p53基因突變，一是野生p53蛋白含量增加。本文7/12例p53蛋白陽性，其中2例＋，3例＋＋,2例＋＋＋。

　　EBER是一種EB病毒編碼的功能性的RNA，對細胞的生長調節起調節作用，它存在于細胞核內，拷貝數高達107/細胞，檢測起來比較敏感。因此EBER的檢測是EBV感染的有力證據。研究表明鼻咽部T細胞淋巴瘤和EB病毒感染有著很高的相關性。本文17/24例（65.4％）EBER陽性，定量分析陽性細胞率在10％～90％之間，與文獻報道一致^[16]。

　　PCR－SSCP原理，通過PCR擴增正常基因及待測基因，變性使其變為單鏈，即使正常鏈與待測鏈僅有一個bp的差別，其構象就不同，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時，條帶就有差異，待測鏈電泳條帶比正常增多或減少或位置不同，即發生了突變。擴增片段小于200bp時，敏感性可達90％^[17]。p535,6，7,8外顯子均小于200bp。5,8,7,6是p53常發生突變的外顯子，突變率依次遞減，因此，本文選取了5,7,8三個外顯子研究，外顯子5突變4/12例(33.3％)陽性，外顯子7突變1/12例(8.3％)陽性，外顯子8突變3/12例(25％)陽性，與文獻報道一致。

　　已有文獻報道，霍奇金病，皮膚T細胞淋巴瘤中EBV感染與p53突變缺乏相關性^[18]。本文就目前結果顯示，鼻咽部T細胞淋巴瘤（NPT）中EBV感染與p53蛋白及基因改變無明顯相關性，這種共性是由于樣本的原因還是有共同內在機制尚有待于進一步探討；但是EBV感染與p53蛋白及基因改變無相關性並不排除EBV編碼的LMP－1,EBNA－2及其它蛋白，進而影響p53,MDM－2，這也需進一步的研究；至于p53突變致瘤的機制是否是通過影響其下遊p21的突變，將做進一步探討。

　　3.2　p53蛋白改變與p53基因突變的關系

　　以p53蛋白的檢測為標準進行分析，p53基因突變（PCR－SSCP）與p53蛋白表達（SABC）符合率為83％，敏感率85.7％，假陰性率20％。因此p53蛋白表達（SABC）一定程度上反映了p53基因突變（PCR－SSCP)，但二者又有差異，這是因為近年來研究表明有使p53蛋白穩定性增加的因素存在，所以可用免疫組化方法檢出，實際p53並未突變。另外PCR－SSCP檢測p53突變雖然敏感，但是：1)對于p53整個外顯子缺失尚不能檢出。2)本實驗未檢外顯子6,9等。3)SSCP本身敏感性所致。總之，免疫組化（SABC）檢測p53突變，簡便易行，有一定意義，但有一定局限性 。PCR－SSCP檢測p53突變步驟復雜，但極為敏感。當用兩種方法檢測均為陽性時，提示p53發生了突變。

　　基金項目：本文課題受衛生部科學研究基金(96－1－259)資助

　　作者單位：高子芬　姜芬　潘增剛　北京醫科大學病理學系（北京市　100083）

　　王洪海　解放軍空軍總醫院病理科

　　田君才　甘肅省酒泉地區醫院

參考文獻

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