造血細胞體外擴增的研究進展

　　國外醫學輸血及血液學分冊1999年第22卷第4期

　　孔佩豔週燕虹郭朝化綜述羅成基審校

　　摘要造血細胞體外擴增是一項具有廣泛應用前景的新技術，而造血幹/祖細胞純化方法和細胞因子作用機理，以及造血細胞對細胞因子的反應性是體外擴增研究的重要方面，近年的研究已日趨深入。本文綜述上述方面的研究進展。

　　關鍵詞：造血細胞體外擴增細胞因子

　　造血細胞體外擴增是近年發展起來的新技術，由于其具有廣泛的臨床應用前景，因而受到廣泛關注。配伍使用多種細胞因子或持續灌注培養的造血細胞體外擴增已取得一定經驗和成果，然而還有許多懸而未決和有爭議的問題，有待進一步深入研究。本文綜述有關方面的最新研究進展。

　　1分選用于體外擴增的造血祖細胞的新方法

　　體外擴增造血細胞多以分選的造血幹/祖細胞作為擴增的細胞基礎。如果用于分選的細胞標志不恰當，則分選過程本身即造成造血幹細胞的丟失，進而也可導致體外擴增後造血細胞移植的失敗，因此選擇理想的分選造血幹/祖細胞的標志是體外擴增造血細胞的一個關鍵問題，值得進一步深入研究。

　　cD34作為選擇造血幹/祖細胞的標志是近年來最廣泛被採用的方法，而且無論人或動物的造血細胞均可以此方法加以分選。但最近有學者對 cD34陽性與造血幹細胞的關系提出了質疑^[1~4]。

　　1996年， osawa等^[1]通過一系列實驗研究首先提出，成年小鼠骨髓造血幹細胞位于 cD34低表達或陰性組分（ cD341o/-），輸入單個小鼠 cD341o/-、 c-Kit+、 sca-1+及系標志陰性（ lin-）細胞可使21%的受者獲得長期淋巴造血系統重建。而小鼠的 cD34+c-Kit+Sca-1+Lin-造血細胞則顯示早期但不能維持的多系造血重建，提示這些細胞為具有多系分化功能而缺乏自我更新的造血祖細胞。

　　以後的實驗進一步證實了 cD34^-造血幹細胞的存在。用熒光 dNA結合染料 hoechst33342染色小鼠的骨髓細胞，然後用雙波長流式細胞儀的方法，可分離出能夠重建致死量照射受體小鼠造血功能的骨髓幹細胞，它們是一類體積很小且均一的細胞群體，且為 cD34-Lin-細胞。用同樣的方法對人類、羅猴和豬骨髓細胞的研究也表明存在迄今尚未被認識的、缺乏 cD34表面標志的造血幹細胞群體^[2]。另有報道提出表型為 thy-1lowLin-/lowSca-1+(TLS)的小鼠造血幹/祖細胞中有15%為 cD34-細胞。體外克隆分析和對經致死量照射小鼠的造血重建研究顯示， tLS中大約95%的 cFSs、 cFU-S、 cAFCs是 cD34+細胞，而更早期的長期重建造血細胞則同等分布于 cD34+和 cD34-的 tLS細胞^[3]。

　　同時用 hoechst33342和派若寧 y作 dNA和 rNA染色可用以分離人骨髓屬于 g0期的 cD34+細胞（ g0CD34+）^[5]。與屬于 g1期的 cD34+細胞相比， g0CD34+細胞具有對細胞因子刺激反應延遲和富含長期培養起始細胞的特征。對 g0CD34+細胞的激活動力學分析發現，這些造血幹細胞的造血能力和對細胞因子刺激反應方面仍存在相對的差異。在體外用 sCF、 flt3配體或Ⅰ l-3單獨刺激培養7天後，以克隆增生分析細胞的增殖能力和維持克隆形成細胞前體（ pre-CFC）的能力，表明一些細胞的功能狀態仍處于靜止期，而另一些細胞則已完成連續的分裂週期。這些結果提示細胞對不同刺激的分裂反應和維持造血功能之間的關系值得進一步深入研究。

　　由于 cD34+造血細胞仍是一個異質性的細胞群體，在這個群體中如何進一步純化造血幹細胞以提高造血細胞體外擴增的效果也有較多的研究報告。在用 hoechst33342（ hst）分離靜止期細胞的同時，用 rhodamine123(Rh123)分離代謝不活躍的細胞，兩者結合在 cD34+細胞中進一步純化出 cD34+Hst^dimRh123^dim(CD34+d/d)和 cD34+Hst^brightRh123^bright(CD34+b/b)細胞。對這些在有絲分裂和代謝功能上均一的 cD34+造血細胞的細胞週期狀態、前體細胞含量、維持體外造血的能力和 lTC-IC含量分析表明， hst和 rh123染色結合 cD34免疫熒光檢測可分離人造血幹/祖細胞中靜止的亞群，即 cD34+d/d細胞，它們具有與幹細胞相關的功能特性，提示可作為用于體外擴增及體細胞基因治療的造血幹細胞的理想選擇^[6]。單獨用 rh123染色也可在 cD34+造血細胞中進一步富集人造血幹細胞^[7，8]。

　　最近提出了一種新的造血幹/祖細胞的表面標志， aC133，它可與一種新的雜交瘤細胞系所產生的抗幹細胞糖蛋白抗原的單克隆 igG抗體（分子量為120kD）發生特異性結合反應。 aC133抗原選擇性地表達于人胎肝、骨髓和外週血中 cD34+造血幹/祖細胞表面，因此 aC133可替代 cD34而作為選擇用于擴增和移植的造血幹/祖細胞的標志^[9]。

　　2對細胞因子在造血細胞體外擴增中作用的深入探討

　　如前所述，造血細胞體外擴增方法還需要多方面的改進，但刺激造血的細胞因子的存在仍是最基本的條件，因此深入研究促進早期造血細胞自我更新和高度增殖的細胞因子及其作用規律，並進一步研究和克隆新的刺激造血的細胞因子，不僅可進一步提高造血細胞體外擴增應用的臨床效果，還有利于研究細胞內調節途徑和促進基因治療的發展。

　　在已有的造血刺激因子中，目前認為對體外擴增早期造血細胞最有效的是 flt3配體和 tPO^[10]，而且兩者合用時伴有較少的細胞分化^[11]。在無血清的液體培養體系中，研究16種細胞因子對 cD34+CD38-細胞的體外擴增作用結果顯示^[11]， flt3配體和 sCF、 iL-3合用培養10天，可使 lTC-IC擴增大約30倍；而當單獨使用每種細胞因子時，則僅有 flt3和 tPO可刺激 lTC-IC的擴增，但由 tPO誘導擴增的 lTC-IC中進一步分化產生的克隆形成細胞（ cFC）卻是紅系細胞，其機理尚不清楚。單獨對 cFC作用最強的是 iL-3，而並不是 flt3配體。

　　有作者在含有 iL-3、 iL-6和粒細胞集落刺激因子（ g-CSF）的液體培養體系中，比較 flt3配體和 sCF對 cD34+細胞作用的差別^[12]。結果顯示，在培養21~28天時，含 flt3配體的培養可產生更多數量的造血祖細胞，且當加用微血管內皮細胞作為支持基質時，含 flt3配體體系的擴增作用進一步增強，證實 flt3配體結合其他造血刺激因子可有效擴增造血祖細胞，並有利于保存和可能擴增能夠長期產生造血祖細胞的造血幹細胞。 flt3配體與 sCF、 iL-3伍用在一個大規模的攪拌懸浮培養中可使臍血 cD34+細胞的 lTC-IC擴增8±3倍， cFC擴增45±36倍^[13]。

　　在多種刺激因子存在的混合培養體系中，用變量的多參數分析方法確定其中每種細胞因子所起作用的重要性是最近報道的方法^[14]。用此方法在 sCF、 iL-3和 iL-6存在的基本體系中，分析 flt3配體、巨核細胞生長和發育因子（ megakaryocyte growth and development factor,MGDF）、 ePO和 g-CSF對不同細胞群擴增的調節作用，認為 ePO、 g-CSF和 flt3配體對晚期祖細胞群有明顯的刺激作用，其中 flt3配體和 ePO對 cD34+細胞的擴增也起很關鍵的作用，而 mGDF和 flt3配體對 bFU-E擴增最重要，同時 flt3配體對 cFU-GM的擴增也有很強的作用。在所分析的細胞因子中沒有發現對巨核細胞集落形成單位（ cFU-MK）有明顯刺激作用的因子。此外，研究還顯示 flt3配體和 mGDF對獲得高水平的 lTC-IC擴增是必需的，即體外擴增早期造血幹/祖細胞需要這兩種細胞因子的參與。

　　3不同來源的造血細胞體外擴增能力的異質性

　　文獻報告的造血細胞體外擴增研究結果常存在較大的差異。即使是在同樣的細胞因子組合使用條件下，細胞的擴增能力和移植能力方面仍有很大差別。出現此種現象的原因除培養條件等因素外，所培養造血幹/祖細胞的來源不同可能也是其重要原因之一。從人胎肝、臍血和成人骨髓分離 cD34+CD38-和 cD34+CD38+造血祖細胞亞群，並對其生長特性、細胞因子需要及對細胞因子的效應作比較分析^[15]的結果發現：①成人骨髓 cD34+細胞中 cD38-細胞的比例明顯低于胎肝和臍血；②成人骨髓中 cD34+CD38-和 cD34+CD38+細胞亞群之間在功能上的差別明顯大于胎肝和臍血；③這些造血祖細胞對細胞因子的效應和它們在個體發生學上有年齡之間存在負相關關系，而對細胞因子的需要與個體的年齡之間則為正相關關系；④在經典的半固體培養體系中，只有在發生學上最早的細胞即胎肝細胞可自發產生克隆，臍血和成人骨髓均不能見到；⑤幹擾素-γ（ iFN-γ）和巨噬細胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)對這些細胞調節作用的程度也取決于不同來源祖細胞在個體發生上的年齡差異： iFN-γ僅選擇性地抑制成人骨髓的 cD34+CD38-細胞亞群，但可同等程度地抑制胎肝和臍血的 cD34+CD38-和 cD34+CD38+細胞；對成人骨髓有作用的 mIP-α，對胎肝和臍血造血祖細胞卻不存在任何刺激或抑制的作用。上述結果證實胎肝、臍血和成人骨髓的造血幹/祖細胞之間在功能和生物學特性上存在重要的差異，提示我們在進行造血細胞體外擴增時要充分考慮細胞來源的因素，且進一步明確它們之間的差別，對有目的地進行體外擴增、確定幹細胞移植策略及成功地進行基因轉染均有重要的意義。

　　對人骨髓、臍血和外週血 cD34+細胞在適當的細胞因子刺激條件下的體外擴增能力進行研究的結果表明，不同來源的 cD34+細胞均可獲得明顯的體外擴增^[16]，但也有報道認為經動員後的外週血 cD34+細胞中雖含有較骨髓更多的 lTC-IC，但其體外擴增能力很有限^[17]。所用的動員方案是給予腫瘤患者大劑量環磷酰胺後再給予 g-CSF、 gM-CSF、 iL-3、 pIXY321其中一種，或者這些因子合用作為動員劑。經測定動員後的外週血 cD34+細胞在體外擴增後產生祖細胞、 cD34+細胞和 lTC-IC的能力，並與骨髓和臍血 cD34+細胞在同樣下擴增後的細胞相比較，結果表明，雖然形成克隆的祖細胞數和 cD34+細胞數均可增多，但 lTC-IC僅為未培養細胞的50%，也明顯低于擴增培養後的骨髓和臍血細胞^[17]。

　　另一項研究結果表明，外週血 cD34+細胞存在細胞因子高反應和低反應兩種細胞群^[18]。在多種細胞因子存在條件下體外擴增培養8天的外週血 cD34+細胞，經熒光染料 cFDA-SE（5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）和流式細胞儀篩選出低頻率分裂（≦5次）細胞（即 cFDA-SEbright細胞）和高頻率分裂（＞5次）細胞（ cFDA-SEdim細胞）。對兩種細胞表面標志的分析表明， cFDA-SEbright細胞的表面抗原表達與新鮮分離的 cD34+細胞相似，而 cFDA-SEdim細胞則顯示下調 cD34抗原表達並獲得分化標志，同時 cFDA-Sebright部分較新分離的 cD34+細胞和 cFDA-SEdim細胞明顯富集 cD105（ endoglin）陽性造血祖細胞。功能研究提示 cFDA-SEbright細胞的克隆形成能力分別較新鮮分離的 cD34+細胞和 cFDA-SEdim細胞高3倍和10倍，此部分細胞含有絕大多數 lTC-IC，比新鮮分離的 cD34+細胞高2.8倍。 rT-PCR和 western blot分析顯示 cFDA-Sebright細胞具有明顯高的 bcl-2RNA和蛋白水平，提示這些細胞因子低反應的循環 cD34+細胞代表功能、表型、及分子水平上具有原始造血細胞前體生物學特征的多能幹/祖細胞群體。

　　隨著造血細胞體外擴增技術逐漸過渡到臨床實驗階段，不同個體間骨髓細胞擴增能力是否存在差異的問題也開始受到重視。對小鼠的研究已經顯示在不同的近交系之間，骨髓細胞長期體外培養的持續時間有很大的變化，其造血幹細胞的短期和長期造血重建能力也明顯不同^[9]，而且利用不同鼠株間骨髓 lTC-IC的差別已開始克隆影響幹細胞生物學行為的相關基因^[20]。進一步了解這些差異的生物學基礎，可能有利于闡明造血幹細胞在基因水平的調節機制^[21]。

　　對人類不同個體間骨髓細胞體外擴增能力的研究報告尚少。 koller等^[22]研究了52例正常供者骨髓 cD34+細胞的體外擴增能力，結果顯示相同數量的 cD34+Lin-細胞經同樣條件的擴增培養後，收獲細胞的數量差別很大，其中細胞總數的變異系數（ cV）為69%， gM-CFU數的 cV值達90%。在有預先培養的基質細胞層存在時，這種差異可明顯縮小，細胞總數和 cFU-GM的 cV值分別降至41%和54%。並且在基質細胞存在的條件下，不同供者的 cD34+細胞顯示廣泛的基質依賴的進一步擴增，細胞總數增加1.2~14倍（平均3.5倍）， cFU-GM數值加1.7~24倍（平均6.5倍），而改變可溶性細胞因子組合僅能夠改變細胞的擴增水平，卻並不能縮小不同供者間的差異。含有同樣數量 cD34+Lin-細胞的骨髓單個核細胞的培養，可獲得數量最多且最一致的細胞總數和 cFU-GM量，其 cV值分別是17%和46%，這可能是由于骨髓單個核細胞可提供包括內源性基質細胞在內的輔助細胞環境所致。此研究結果對設計造血細胞培養擴增的臨床實驗和認識人類造血幹細胞生物學行為的多樣性，具有重要的指導意義。

　　對正常供者的特征如年齡、性別、體重和身高等與細胞功能的關系進行了分析，未發現有相關關系^[22]。因此認為所觀察到的不同供者 cD34+細胞體外擴增能力的差別可能也是由于基因的多樣性或其他由供者決定的變異性所致。如果這些人類細胞擴增能力的差別至少部分是由基因變異引起，那麼克隆小鼠造血幹細胞生物學行為相關基因的方法^[21]可能同樣有助于闡明有關人類造血幹細胞功能基因調控的分子機制。

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