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大腸癌人巨細胞病毒感染與p53基因突變的相關性
中國腫瘤臨床1999年第26卷第6期
侯治富 王維忠 楊紹娟 張文嵐 吳曉冬 徐殿文
關鍵詞：大腸癌巨細胞感染 p53基因突變
盡管人巨細胞病毒（HCMV）感染與人類腫瘤的關系還不十分清楚，但HCMV感染可導致原癌基因（如myc基因）的表達、生長因子轉錄、白細胞介素合成增加，酪氨酸羥化酶、多巴胺－β－羥化酶表達減少等。還有實驗證實，神經胚細胞瘤體外培養中感染HCMV後，增加了瘤細胞的動能性（motility）和轉移性。近年的臨床研究中，報道了HCMV與宮頸癌關系十分密切，但有關大腸癌的報道較少。本文就大腸癌HCMV感染與p53基因突變關系進行了初步研究。
1 材料與方法
1.1 標本來源
收集1994～1996年白求恩醫科大學中日聯誼醫院外科切除大腸癌組織共60例，均經病理證實，並進行了Dukes′分期和組織分化程度分型。患者年齡38～72歲；男42例，女18例。
1.2 DNA模板制備
取－80℃凍存組織約1g，經組織研磨器研磨，加入1mlDNA裂解緩衝液，置55℃1小時，95℃15分鐘，經13000rpm離心10分鐘，上清即為DNA模板。再0.8％～1％低電滲瓊脂糖凝膠電泳，以排除降解的模板。
1.3 PCR－SSCP檢測p53突變
取上述DNA模板液10μl（約1μg），加入50μlPCR反應體系內 （dNTP250μmol/L,MgCl23.0mmol/L;KCl25mmol/L：TagDNA聚合酶2U;引物濃度為0.25pmol/L）。p53基因第2,3外顯子引物P1:5′－CCCACTTTTCCTCTTGCAGC;P2:3′－AGCCCAACCCTTGTCCTTAC,PCR產物長度為278bp;第4外顯子引物P1:5′－CCCTGTCATCTTCTGTCCCT;P2:3′－AGCCCCAGTGGGCAACTGA,產物長度為121bp；第5外顯子引物P1:5′－TCTGTTCACTTGTGCCCTGACTTTC;P2:3′－ACCCTGGGCAACCAGCCCTGTCGTC,產物長度為282bp。PCR循環參數為：95℃充分變性5分鐘，再行95℃60秒，55℃50秒，72℃120秒，共35個循環，最後72℃充分延伸5分鐘。取PCR產物8μl，與6倍加樣緩衝液混勻，加于2％低電滲瓊脂糖凝膠電泳，5v/cm，30分鐘後經EB染色，在紫外反射透射儀上觀察擴增效果。陽性者，取PCR產物7μl，與36％甲酰胺、0.05％溴酚藍混合，95℃加熱變性5分鐘，置冰水冷卻，取7μl加入含10％甘油、12％非變性聚丙烯酰胺凝膠，室溫下以5v/cm電泳4～6小時。同時做陽性、陰性DNA和空白對照，EB染色20分鐘後用紫外反射透射儀觀察結果。
1.4 HCMVPCR檢測
DNA模板制備同上。HCMVPCR引物序列P1:5′－CCACCCGTGGTGCCAGCTCC－3′；P2.5′－CCC,GCTCCTCCTGAGCACCC－3′,產物長度159bp。PCR循環參數為94℃60秒，52℃120秒，72℃120秒，總共35個循環。產物鑑定經2％瓊脂糖凝膠電泳，5v/cm，1小時，用EB染色20分鐘，紫外反射透射儀上觀察結果。
1.5 統計學方法
實驗所得計數數據採用Kendall等級相關分析和χ2檢驗。顯著性差異標準定于P≦0.05。
2 結果
2.1 大腸癌HCMV感染與大腸癌組織分化、臨床Dukes′分期的關系
在60例大腸癌中，HCMVPCR陽性檢出率為31/60(51.67％)；不同組織分化的HCMV感染率分別為：高分化型43.75％，中分化型50.00％，低分化型55.55％，未分化型62.50％。Dukes′分期中，B1期為50.00％，B2期為50.00％，C1期為45.83％，D期為62.50％。經χ2檢驗和Kendall等級相關分析顯示各組間HCMV感染率無顯著差異（χ12=0.85，χ12=0.002，P＞0.05，τ1=0.07，τ2=0.003）。
2.2 大腸癌HCMV感染與p53基因突變的關系
在31例HCMV感染的大腸癌中，p53基因突變率為29.03％(9/31)，與非HCMV感染組比較，p53基因突變率顯著增高（χ2=4.80,P＜0.05，τ＝0.11）。
2.3 大腸癌HCMV感染與大腸癌不同分化程度、臨床分期中抑癌基因p53突變的關系（表1,2）。
表1，2可見，HCMV感染與大腸癌的組織分化程度、p53基因突變無顯著差異（χ2=0.63和1.59，P＞0.05）；HCMV感染的病例，Duhes′分期越晚p53基因突變率越高，各組間差異顯著（χ2=4.10,P＜0.05）。
表1 大腸癌HCMV感染與大腸癌組織分化程度、p53基因突變的關系
|
大腸癌組織分化程度 |
HCMV(＋) |
HCMV(－) |
| 例數 |
突變例數 |
突變率(％) |
例數 |
突變例數 |
突變率(％) |
| 高分化 |
7 |
2 |
28.57 |
9 |
0 |
0 |
| 中分化 |
8 |
1 |
12.50 |
8 |
0 |
0 |
| 低分化 |
11 |
4 |
36.36 |
9 |
2 |
22.22 |
| 未分化 |
5 |
2 |
40.00 |
3 |
0 |
0 |
HCMV(＋)組χ2=0.63 P＞0.05 Kendall τ=0.08 HCMV(－)組 χ2=1.59 P＞0.05 Kendall τ=0.07
表2 大腸癌HCMV感染與Dukes′分期、p53基因突變的關系
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Dukes′分期 |
HCMV(＋) |
HCMV(－) |
| 例數 |
突變例數 |
突變率(％) |
例數 |
突變例數 |
突變率(％) |
| A |
- |
- |
- |
-- |
-- |
- |
| B1 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
| B2 |
5 |
1 |
20.00 |
5 |
0 |
0 |
| C1 |
11 |
3 |
27.27 |
13 |
1 |
7.69 |
| C2 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
| D |
10 |
5 |
50.00 |
6 |
1 |
16.67 |
HCMV(＋)組χ2=4.10 P＜0.05 Kendall τ=0.07 HCMV(－)組 χ2=1.53 P＞0.05 Kendall τ=0.07
3 小結
大腸癌的病因尚未明確，多數認為是一種多基因參與、多階段演變的疾病。Kovacs等研究了HCMV感染的臍靜脈內皮細胞p53基因呈現過度表達，而且主要集中在細胞核內，呈與細胞漿分離的狀態。Cinatl等發現，HCMV感染使Bcl－2基因過度表達。本組資料中的60例大腸癌HCMVPCR陽性率為51.67％，明顯高于本地區獻血員。經Kendall等級相關分析發現，HCMV感染與大腸癌的Dukes′分期、組織分化的程度無關，但HCMV感染與p53突變有關；p53基因突變率隨病情進展而增加，這一改變與組織分化程度無關。證實了大腸癌中p53基因突變與HCMV感染密切相關，其確切機理尚需進一步研究。
基金項目：本文課題受吉林省衛生廳科研基金資助作者單位：侯治富 王維忠 楊紹娟 張文嵐 吳曉冬 白求恩醫科大學第三臨床學院中心實驗室（長春市130031）
徐殿文 吉林省四平市婦嬰醫院
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