骨髓微轉移與乳腺癌預後

　　中國腫瘤臨床1999年第26卷第7期Vol.26No.7　1999

李金鋒　林本耀　徐光煒

　　 關鍵詞：乳腺癌 骨及骨髓微轉移 預後 免疫組織化學 RT－PCR

　　乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤（31％），其死亡率僅次于肺癌而位居第二^[1]，且其發病率仍有逐漸升高趨勢。惡性腫瘤細胞的轉移是主要致死因素，而淋巴結轉移和原發腫瘤大小是目前判斷預後和制定治療方案的主要參考指標。然而，仍有約24％經常規檢查沒有發現任何轉移蹟象的患者將于術後出現復發和轉移^[2]，說明單靠原發腫瘤大小和淋巴結轉移狀況來評估患者的預後，將影響對相當數量患者的正確判斷。骨及骨髓是乳腺癌常見轉移部位之一，約有80％以上的復發轉移患者在疾病發展過程中出現骨轉移，而目前現有的臨床檢查手段，包括X線、骨掃描、堿性磷酸酶和羥脯氨酸（hydroxyproline）檢測等均欠敏感，只有當骨基質（bonematrix）出現破壞時才有意義。近年來，對乳腺癌患者處于亞臨床階段的骨髓微小轉移灶的檢測越來越受到腫瘤學家的重視，本文將有關資料作一綜述。

　　1　骨髓微轉移灶的檢測方法

　　1.1常規細胞學檢查

　　在無骨轉移臨床症狀的患者，常規細胞學檢查陽性率甚低。雖然多點骨髓穿剌活檢是檢測骨髓轉移瘤的有效方法，但對微小轉移灶的檢測價值仍很有限，其最高陽性率僅為3.6％^[3]。

　　1.2應用免疫組織化學（IHC）技術檢測骨髓微轉移

　　乳腺癌為上皮性腫瘤，具有上皮性來源的細胞生物學特征，而骨髓屬間葉組織來源，本身無上皮性抗原的表達，故可應用針對上皮性抗原（如細胞角蛋白－CK、膜上皮抗原－EMA、表皮糖蛋白－EPG等）的單克隆抗體（MoAb）進行IHC染色。一旦骨髓成分中出現染色陽性細胞，再結合陽性細胞所具備的惡性特征，則很易作出骨髓微轉移之診斷。

　　Osborne等^[4]以乳腺癌細胞系（MCF－7）按不同細胞濃度與正常骨髓細胞相混合，然後行IHC染色，能檢測出2×105骨髓細胞中的一個癌細胞，其檢出率達95％，而常規細胞學檢查全部為陰性。Molino等^[5]利用三種不同方法（形態學方法、IHC和流式細胞分析）檢測骨髓中的乳腺癌細胞（MCF－7），結果發現IHC方法的檢測陽性濃度為0.00025％，而形態學分析和流式細胞技術檢測出的陽性濃度分別為0.05％和0.2％，作者認為利用IHC技術檢測骨髓微轉移，無論是敏感性還是特異性方面，均優于其它兩種方法。骨髓穿剌一般于手術當日麻醉後進行，可選擇胸骨、雙側髂前上脊、雙側髂後上脊等單部位或多部位，多部位穿剌的陽性檢出率高于單部位穿剌。一般抽取5～10ml骨髓液，經Ficoll－hypoque液離心分層，吸取淋巴細胞層洗滌後塗片，針對相應特異性抗原行IHC染色來檢測乳腺癌之骨髓微轉移。

　　IHC技術用于乳腺癌骨髓微轉移的檢出率為16％～48％^[4～10]。Singhal等^[6]對116例切除活檢後患者行骨髓穿剌，微轉移陽性率為32％；260例未曾切除活檢的患者陽性率為39％，二者無統計學差異。Diel等^[3]的研究亦證實，手術前和手術後分別檢測骨髓微轉移的陽性率無顯著性差異。說明手術並不增加乳腺癌擴散的機會。另外也證實，乳腺癌即使是早期，亦可能存在腫瘤細胞的血行播散。

　　利用IHC技術檢測乳腺癌微轉移，雖然其診斷陽性率大大提高，但也有一定的局限性，如某些正常骨髓細胞，淋巴類上皮細胞等可能會出現不同程度的交叉反應，以及腫瘤細胞表面抗原表達的不均一性，均可能影響對轉移細胞的正確評判。故實際應用中，應盡量選用兩種以上不同的MoAb（針對胞膜和胞質的抗原尤佳），對組化染色陽性細胞進一步觀察其形態特征，最後方可診斷骨髓微轉移。

　　1.3利用RT－PCR技術檢測乳腺癌骨髓微轉移

　　RT－PCR是近年來發展起來的生物學技術，為RNA診斷提供了一條簡便、靈敏、準確的新途徑，其應用越來越廣泛。具體方法是，對某一特定基因有表達的組織抽提總RNA，經逆轉錄反應合成cDNA，然後以該基因的特異性外顯子序列為引物進行PCR，擴增的cDNA片斷經凝膠電泳分離。因RT－PCR是對某一組織特異基因在mRNA水平的表達檢測，故其檢測腫瘤隱匿性微小轉移灶，無論是敏感性還是特異性方面均優于以往任何方法。與IHC染色相比，即經濟又相對簡單，且敏感性可增加10～100倍。有報道，RT－PCR方法可在107淋巴細胞中找出3個黑色素瘤細胞^[11]；能在106淋巴細胞中找到一個MCF－7細胞[12]；能在107正常細胞中檢測到1個成神經細胞瘤細胞^[13]；能在106正常骨髓細胞中檢測到一個乳腺癌細胞^[7]。

　　RT－PCR方法檢測骨髓中轉移細胞的關鍵依賴于某種基因的組織特異性表達，即這種基因僅在腫瘤細胞（亦可出現于某些正常組織）表達，而在正常骨髓及血細胞中不表達，如酪氨酸酶（Tyrosinase）是生成黑色素的關鍵酶，酪氨酸酶基因在黑色素細胞中特異性表達，已用于骨髓和外週血中惡性黑色素瘤細胞的檢測^[14]。盡管乳腺癌中可有多種基因蛋白的高表達，如多形上皮粘蛋白的核心蛋白（MUCI）、癌胚抗原（CEA）、DF3（一種乳腺癌相關抗原）等，然而，文獻報道中應用最多的乳腺癌轉移標志物為細胞角蛋白19（CK－19）。實際上，細胞角蛋白並非乳腺癌特異蛋白，其為主要表達于上皮類細胞的一組蛋白質（CK－1～CK－20），以CK－19在正常上皮細胞和上皮性癌細胞的表達最為特異。Brown等^[15]在非上皮組織中分別檢測了CK－8、CK－18、CK－19的mRNA，結果顯示，在廣泛的不同種類非上皮組織中均有CK－8和CK－18的表達，而CK－19表達陰性。既然CK－19不在正常造血組織中表達，如果在乳腺癌患者骨髓及外週血中檢測出CK－19基因轉錄物，即可說明有乳腺癌細胞的存在。Datta等^[16]將三種人乳腺癌細胞系：T47D、MCF－7、SKBRs分別以不同濃度與正常人骨髓中的有核細胞混合，用RT－PCR方法檢測其CK－19mRNA表達，結果可檢出106個骨髓有核細胞中的一個癌細胞。證明RT－PCR是敏感、特異、迅速的檢測手段。Schoenfeld等^[7]將MCF－7細胞與正常骨髓細胞按不同濃度混合，然後分別進行細胞塗片IHC染色和RT－PCR分析，結果IHC能檢測出1/105MCF－7細胞，而RT－PCR方法能測出1/106MCF－7細胞，其檢測敏感性比IHC提高10倍。Kruger等^[17]報道利用RT－PCR技術，骨髓微轉移的檢出率為41.7％，4例身體其它部位出現轉移的乳腺癌患者，其中3例查出骨髓微轉移。Schonefeld等^[7]分別用IHC和RT－PCR檢測了75例無明顯遠處轉移的乳腺癌患者的骨髓和外週血，結果：IHC陽性率22％，RT－PCR為35％。在5例骨掃描發現骨轉移的患者中，4例陽性。另4例乳腺癌術後1年以上患者，2例經RT－PCR檢測外週血陽性，其中1例經IHC染色發現骨髓中有瘤細胞。作者還報道4例乳腺原位癌患者中的1例（導管原位癌），經IHC和RT－PCR方法均發現骨髓和血液存在微轉移。該患者接受了乳腺擴大局部切除，仔細病理檢查發現有微浸潤（micro－invasion）存在。此例微轉移的檢出，進一步證實了乳腺癌具有早期播散的特性。

　　最近有報道，先用免疫磁珠法分離癌細胞，再結合RT－PCR（ImmunobeadRT－PCR），以CK－19為標志物，檢測乳腺癌外週血中的瘤細胞，結果能由106白細胞中檢出1個瘤細胞，其敏感性與單用RT－PCR相仿^[18]。

　　RT－PCR聯合Southern雜交技術能夠進一步提高微轉移的檢出率。值得注意的是，有報道利用巢式（nested）PCR進行兩步擴增，結果在正常淋巴結中亦出現CK－19表達，說明某些正常非上皮細胞亦可能有內源性CK－19mRNA模板的極低水平表達。故一味追求敏感性會導致特異性的降低，而以40輪PCR擴增聯合Southern雜交為宜^[19]。

　　2　乳腺癌骨髓微小轉移灶的臨床意義

　　為證實骨髓中檢出的癌細胞具有生物學活性，Sharp等將乳腺癌患者骨髓中分離出來的癌細胞于體外培養，結果其可形成克隆，接種裸鼠亦可形成腫瘤。提示臨床檢測乳腺癌患者骨髓微轉移對預測復發、轉移可能具有重要意義。Cote等^[8]檢測49例Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者，骨髓微轉移檢出率為37％，其中Ⅰ期為23％,Ⅱ期為38％，腋窩淋巴結陰性者為27％，陽性者為41％。平均隨訪29個月，共有12人（24％）出現復發，骨髓轉移最多（6例），其次為肝髒（3例）。骨髓微轉移陽性者復發率為33％，而陰性者僅為3％。若與淋巴結轉移情況相結合，兩者均為陽性的乳腺癌患者，兩年復發率為42％；兩者均陰性者無復發，差異非常顯著。故作者認為，骨髓微轉移的檢測對乳腺癌的預後判定十分重要，並建議根據骨髓微轉移和腋窩淋巴結情況將乳腺癌患者分為高、中、低危險組，並以此來選用相應的輔助治療。在另一報道中，Mansi等[20]檢測350例可手術乳腺癌患者，骨髓微轉移陽性率25％，且與腫瘤大小、腫瘤週圍血管受侵及腋窩淋巴結轉移情況有明顯相關性。經6年隨訪，微轉移陽性者，復發率為48％，而陰性者為25％。再次證實骨髓微轉移陽性的乳腺癌患者，遠處轉移率高，總生存期縮短。然而，對此亦有不同觀點，最近Molino等^[9]報道，對109例Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者于手術前或手術後2～4週行骨髓穿剌檢測微轉移，結果陽性率31.1％，骨髓微轉移與腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移、月經狀態和雌激素受體情況等因素比較，未發現明顯相關性，且對患者無病生存期（DFS）和總生存期（OS）的影響亦無統計學意義。但作者亦認為這種結果可能與隨訪時間短（3年）有關。

　　骨髓及血液中少量腫瘤細胞的檢測，對近年來開展的高危乳腺癌自體骨髓移植（ABMT）或外週血幹細胞移植（PBSCT）亦有實用價值，如果這些治療用細胞中混有腫瘤細胞，無疑將影響其治療效果。

　　3　小結

　　文獻統計表明，骨及骨髓是乳腺癌最易發生轉移的部位之一，並常與其它部位的轉移伴發。近十餘年來，隨著檢測手段的進步，骨髓微轉移的檢出率明顯提高。盡管各家報道不盡一致，但多數認為其與乳腺癌的預後、復發、轉移有明顯的相關性，可作為一種有效的預後指標。結合其它因素，確定出具有早期復發、轉移危險的高危人群，在其發展為臨床轉移之前，給予積極輔助治療。從而渴望降低乳腺癌患者的復發、轉移率，提高生存率，延長生存期。同時，又能使部分低危險（微轉移陰性）患者免于不必要的化療造成的痛苦。骨髓微轉移檢測，尚可作為判定輔助治療療效的指標，亦可作為術後患者隨訪過程中預測復發、轉移的依據。

　　誠然，並非骨髓微轉移的存在預示將來定會出現復發、轉移，尤其是檢測中發現的極少數腫瘤細胞（如IHC發現的單個腫瘤細胞），因為轉移形成仍受多種因素的影響，但至少表明其具有形成顯性轉移的傾向。隨著積累病例的增多和觀察時間的延長，這些微量腫瘤細胞在骨髓中的臨床意義將日趨明了。

　　作者單位：北京醫科大學臨床腫瘤學院北京腫瘤醫院乳腺外科（北京市100036）

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(楊 紅 欣 校 對)

(1998－07－02收稿）