眼鏡蛇血清解毒蛋白的溴化氰裂解肽段與自身神經毒素的結合^△

　　中國醫學科學學院學報1999年第21卷第5期

柴嬰蕾　邵靖宇^#

　　摘　要　目的　為進一步認識眼鏡蛇血清解毒蛋白 (CSAP) 如何與神經毒素結合並解毒。方法　用溴化氰裂解 CSAP 肽鏈中由 Met 羧基端組成的肽鍵，裂解產物經超濾除去分子量小于 10 000 的片段後，用親和層析法得到與毒素仍保持有親和力的肽段。結果　與毒素仍保持有親和力的肽段相當于 Lys2-Met485，Lys2-Met275，Lys276-Met485，Pro444-Met603。結論　CSAP 的3個結構域均具有與毒素分子結合的活性，CSAP 結合的8個毒素分子分散在整個肽鏈的各個段落上。

　　關鍵詞：眼鏡蛇血清解毒蛋白　眼鏡蛇血清白蛋白　眼鏡蛇神經毒素　溴化氰肽鏈裂解反應　親和層析

　　眼鏡蛇血清解毒蛋白 (cobra serum antitoxic protein，CSAP) 是第一個被證實為血清白蛋白的蛇類解毒蛋白 (眼鏡蛇血清白蛋白，cobra serum albumin)，也是第一個被測定氨基酸序列的蛇類解毒蛋白，它為一由 614 個氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，分子量 69 800^﹝1﹞。CSAP 肽鏈結構的基本框架與哺乳動物血清白蛋白十分相似，其 34 個半胱氨酸殘基在肽鏈的分布及形成二硫鍵的模式與已知哺乳動物血清白蛋白基本相似，整個分子也可分為類似的 3 個結構域 (domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。以往研究觀察到每分子 CSAP 約能結合 8 個毒素分子，但其與各毒素分子的結合強度有差別^﹝2﹞。CSAP 與毒素分子的結合位點既可能分散在幾個結構域中，也可能集中于某個區域。本實驗用溴化氰裂解 CSAP，從裂解後肽段與神經毒素分子的結合探討其結合位點。

　　1　材料和方法

　　試劑　Sephadex G-25、G-50，Sepharose 4B (Pharmacia), CM-cellulose 23, DEAE-cellulose 32 (Whatman), CNBr, Dansyl-Cl (Sigma)。其餘試劑均為分析純。

　　材料　(1) 眼鏡蛇血清：採自浙江安吉縣，將眼鏡蛇斷頭取血，室溫放置 3 h，離心取血清，-20℃ 保存。(2) 眼鏡蛇粗毒：採自浙江永康，凍幹粉 -20℃ 保存。

　　方法　

　　眼鏡蛇神經毒素 (NT) 的制備：參照 Kaneda 等^﹝3﹞ 方法，將眼鏡蛇粗毒凍幹粉溶于 1％ 醋酸溶液，上 Sephadex G-50 柱，用 1％ 醋酸洗脫，收集有毒性的蛋白峰冰凍幹燥。將此凍幹粉溶于 0.005 mol/L (pH 5.8) 醋酸鈉緩衝液，上 CM-cellulose 23 柱，用起始濃度為 0.25 mol/L (pH 6.1)、終末濃度為 0.50 mol/L (pH 6.5) 的醋酸鈉緩衝液直線梯度洗脫。

　　純化 CSAP 的制備：眼鏡蛇血清加等體積飽和硫酸銨溶液，4℃ 靜置 4 h，離心 (3500 r/min，15 min)，取上清液上 Sephadex G-25 柱脫鹽，收集蛋白峰冰凍幹燥。此凍幹粉上 DEAE-cellulose 32 柱，先後用吡啶濃度為 0.002 mol/L，氯化鈉濃度分別為 0.04、0.06、0.08 和 0.10 mol/L 的緩衝液 (pH 4.2) 進行階段梯度洗脫。

　　NT-Sepharose 4B 親和層析柱的制備：參照駱愛玲等^﹝4﹞ 方法，最後用 0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.4) 緩衝液平衡備用。

　　CSAP 的溴化氰 (CNBr) 裂解：取 20 mg(0.28 μmol) 純化的 CSAP 凍幹粉溶于 0.9 ml 去離子水中，再加 5.1 ml 的 88％ 甲酸溶液 (甲酸終濃度 75％)，25℃ 裂解反應 16 h 得到肽段溶液，超濾 (截留分子量界限為 10 000)，溶于 3 ml 0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.4) 緩衝液備用。

　　與 NT 結合的 CSAP 裂解肽段的獲得：將上述 CSAP 裂解後制備的肽段溶液上 NT-Sepharose 4B 親和層析柱，平衡 30 min 後，先用起始 pH 6.5、終末 pH 4.5 的醋酸銨緩衝液 (10 mmol/L) 直線梯度洗脫，再用含 0.5 mol/L 氯化鈉的 0.1 mol/L 醋酸鈉 (pH 4.0) 緩衝液洗脫。

　　肽的 N-末端氨基酸 DNS 分析：按張龍翔等^﹝5﹞ 方法。

　　2　結果和討論

　　經 CM-cellulose 23 柱分離得到神經毒素 (NT)，用醋酸纖維素薄膜電泳檢測，NT 能與 CSAP 結合而形成新的區帶。

　　經 DEAE-cellulose 32 柱分離得到 CSAP (醋酸纖維素薄膜電泳檢測在白蛋白位置)，收集該蛋白冰凍幹燥，用 PAGE 及 SDS/PAGE 鑑定其純度，均為單一區帶。該純化的 CSAP 經 CNBr 裂解並超濾去除分子量 1萬以下的肽段後，經 SDS/PAGE 檢測，得到 6 個裂解肽段 (以字母 a～f 順序表示)，分子量分別為 56 500±800、32 500±1 400、30 200±2 600、21 800±1 100、15 200±1 700 和 13 200±1 600 (附圖)。

附圖　SDS/PAGE 電泳檢測 CSAP 的溴化氰裂解肽段

Fig　SDS/PAGE of fragments of the CSAP

　　Lane A:　fragments of the CSAP;

　　Lane B:　the marker proteins

　　The top line of lane A is uncleaverd CSAP

　　利用 NT-Sepharose 4B 親和層析柱分離 CSAP 的裂解肽段時，用低鹽濃度的緩衝液洗脫沒有收集到肽段，表明這些肽段與 NT 的結合比較牢固。後用含 0.5 mol/L 氯化鈉的 0.1 mol/L 醋酸鈉 (pH 4.0) 緩衝液洗脫，收集到 4 個能與 NT 結合的 CSAP 裂解肽段。用 SDS/PAGE 測定其分子量，分別與 a、b、c 和 e 肽段相當。經肽 N-末端氨基酸 DNS 分析，這 4 個肽段的 N-末端氨基酸為 Pro、Gly 和 Lys。

　　綜合以上結果，推測這 4 個肽段應為 Lys2-Met485，Lys2-Met275，Gly276-Met485 和 Pro444-Met603。這些肽段分別位于 CSAP 分子中的 domain Ⅰ+Ⅱ+60％ⅢA，domain Ⅰ+54％ⅡA，46％ⅡA+ⅡB+60％ⅢA 和 75％ⅢA+88％ⅢB。提示 CSAP 裂解後，其某些肽段仍能回復與神經毒素結合的構象，保持與神經毒素結合的能力。CSAP 與神經毒素結合的位點可能分散在其分子的 3 個結構域中，故每個 CSAP 分子可結合多個毒素分子而使眼鏡蛇血清中遊離的毒素濃度很低，從而使眼鏡蛇免于遭到其自身的傷害。

　　作者單位：浙江大學醫學院生物化學教研室，杭州 310031

　　參考文獻

　　1　王曉路， Havsteen B， 邵靖宇. 眼鏡蛇血清解毒蛋白基因的分子克隆和序列分析. 中國醫學科學院學報， 1996， 18(4)：263～272

　　2　Shao JY, Shen H, Havsteen B. Purification, characterization and binding interactions of the Chinese-cobra (Naja naja atra) serum antitoxic protein CSAP. Biochem J, 1993, 293 (Pt 2): 559～566

　　3　Kaneda N, Sasaki T, Hayashi K. Primary structures of cardiotoxin analogue Ⅱ and Ⅳ from the venom of Naja naja atra. Biochim Biophys Acta, 1977, 491 (1): 53～66

　　4　駱愛玲， 黃巨富. 免疫親和吸附劑制備方法的某些改進. 植物生理學通訊， 1991， 27 (2)：123～124

　　5　張龍翔， 張庭芳， 李令媛. 生化實驗方法和技術. 第2版. 北京：高等教育出版社， 1997. 61～66