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絕望行為模型大鼠腦內fos蛋白免疫陽性神經元的分布
中華神經科雜志2000年第33卷第3期
鄭泰吉 崔尚允 李光昭 韓東日 金昌洙 孟凡強
摘 要 目的 探討抑鬱症的神經元結構及發病機制。方法 採用不同強度強迫遊泳應激造成絕望行為（BD組）模型和單純強迫遊泳模型（對照組）大鼠（Wistar系雄性，體重160～180 g）各10只，在其端腦、間腦、中腦和腦橋切片上各做抗fos蛋白免疫組化染色，40倍光鏡下觀察和計數各部位內fos蛋白免疫陽性（FLI）神經元及其數目，並進行兩組之間的比較。結果 BD組與對照組40倍光鏡下FLI神經元數目比較，前額內側皮質﹝BD組（49.4±3.7）個,對照組（18.9±4.8）個,P＜0.01﹞、隔外側核﹝BD組(41.6±3.2)個,對照組(11.4±3.0)個,P＜0.01﹞、下丘腦室旁核﹝BD組(20.8±4.4)個,對照組(6.9±2.0)個,P＜0.05﹞、下丘腦外側區﹝BD組(12.4±1.6)個,對照組0個,P＜0.01﹞、中腦中央灰質﹝BD組(46.3±5.2)個,對照組(20.2±4.3)個,P＜0.01﹞、中腦網狀結構﹝BD組(6.5±1.2)個，對照組0個,P＜0.01﹞、中縫背核﹝BD組(4.8±0.4)個,對照組0個,P＜0.01﹞多于對照組；額皮質V層、中腦網狀結構和中縫背核內見到胞核深染、胞漿淺染的FLI神經元胞體。結論 抑鬱症的發病可能與腦內犒賞系統的強烈而持續的興奮引起神經元內Ca2+過載而導致神經元變性有關。
關鍵詞：抑鬱症；神經變性；行為障礙；原癌基因蛋白質c-fos類
利用fos蛋白抗體的免疫組化法是一種反映神經功能通路的新方法，常被用于神經科學的研究，在抑鬱症研究中應用較少。我們在絕望行為（BD）模型大鼠腦上應用該法觀察了fos蛋白免疫陽性（FLI）神經元的分布情況，並以單純強迫遊泳（SFS）模型大鼠做為對照組，找出了該神經元的分布在兩組內存在差異的部位，旨在探討抑鬱症的神經元結構及發病機制。
材料和方法
一、材料
動物模型：採用體重160～180 g的Wistar系雄性大鼠30只（延邊大學醫學院實驗動物科提供），先在安靜、溫暖（25℃）、避免強光的環境內飼養5天。將動物隨機分為2組，經受BD第1，2次試驗（以下分別簡稱第1次試驗、第2次試驗）的為實驗組（n=20），只經受第2次試驗的為對照組（n=10）。
二、方法
1. BD試驗：按Porsolt 等﹝1﹞的方法進行。在高42 cm、底面直徑20 cm的圓柱形透明玻璃缸內倒入25 ℃的自來水使水位達到20 cm，將動物放入水缸內使其遊泳15 min（第1次試驗），並用以1/100 s為單位的秒表（HITACHI牌）測定其在遊泳的前5 min內所呈現的不動狀態時間總和。24 h後，在同樣條件下又使動物遊泳5 min（第2次試驗），測定此期間內的不動狀態時間總和。第2次試驗中的不動狀態時間總和長于第1次試驗的前5 min內者定為BD組。
2．免疫組化法：BD試驗結束後第2小時，用1%戊巴比妥鈉腹腔內麻醉動物，經左心室和升主動脈先以生理鹽水衝洗，繼而用pH7.4、含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩衝鹽液（PBS）灌注固定。取腦，腦塊放入灌注液進行後固定4 h，再放入含30%蔗糖的PBS至下沉。振動切片（4 ℃），片厚40 μm,從嗅結節至三叉神經根平面連續橫切。切片分為3套，第1套切片按抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶（ABC）法進行抗fos蛋白免疫組化染色：以下每一步驟結束後均用PBS洗3次，每次15 min。第1套切片放入：（1）0.3%H2O2孵育10 min；（2）兔抗c-fos(fos蛋白抗體，Oncogene science公司，1︰500)、0.3% triton X -100、 正常羊和牛血清中孵育24 h（4 ℃）；（3）生物素標記的羊抗兔IgG(VECTOR公司，1︰200)中孵育1 h（室溫）；（4）ABC（VECTOR公司，1︰500）中孵育1 h（室溫）；（5）在含有0.02%二氨基聯苯胺、0.04% niCl2和0.005%H2O2的NaH2PO4溶液中成色5～7 min（室溫）。第2套切片用1%中性紅染色。第3套切片做免疫組化對照試驗：用0.01 mol的PBS代替第1級抗體，按ABC法進行。40倍光鏡下觀察和計數各部位內FLI神經元及其數目。
3．統計學處理:兩組不動狀態時間的比較，用t′檢驗；FLI神經元數目的比較按部位（參照Paxinos等編制的1986年版大鼠腦圖譜，）用單因素方差分析。
結果
一、兩組的不動狀態時間
20只實驗組動物中，10只（佔50%）因在第2次試驗中的不動狀態時間短于或等于第1次試驗而未用于本研究。其餘的BD組與對照組的不動狀態時間分別為(222.2±11.5）s和(62.1±1. 7)s,差異有非常顯著性（t′=44.87，t′0.01=3.25,t′＞t′0.01，P＜0.01）。
二、BD組與對照組FLI神經元分布比較（表1）
FLI產物經NiCl2強化後呈黑色、顆粒狀，光鏡下顯示其主要分布于胞核，胞核染成黑色的細胞即為FLI神經元。核的染色有深、中、淺等3種。對照組FLI神經元分布于額、頂、梨狀、扣帶皮質，隔外側核，尾殼核，屏狀核，杏仁核，海馬，丘腦室旁核，下丘腦室旁核、室週核、視上核，中腦中央灰質，藍斑等部位；染色深度以中、淺兩種為主。BD組與對照組比較，40倍光鏡下FLI神經元數目在前額內側皮質、隔外側核、下丘腦室旁核、下丘腦外側區、中腦中央灰質、中腦網狀結構、中縫背核BD組明顯增加(表1），染色深度以深、中2種為主。
討論
將BD模型動物在水中的不動狀態時間總和作為其行為學觀察指標，而這種不動狀態時間特異性地只被各種抗抑鬱療法所縮短﹝1﹞，故本模型適用于抗抑鬱藥篩選試驗和抑鬱症的生物學研究。我們認為，本模型具有制作方法簡便、效度和信度較高等特點。
fos蛋白是即刻早期表達基因c-fos編碼產生的一種核蛋白，具有當機體受到外界刺激時在神經系統內迅速出現的特性。因此，利用fos蛋白抗體的免疫組化法有助于在細胞水平探討各種精神障礙的發病機制﹝2，3﹞。Bang等﹝4﹞報道（觀察部位限于端腦和間腦），與對照組比較，BD組前額內側皮質、隔外側核、下丘腦室旁核等部位內的FLI神經元數目增加，這與我們的部分結果一致。但本結果還顯示，除端腦和間腦外，BD組下丘腦外側區、中腦中央灰質、中腦網狀結構、中縫背核內FLI神經元數目也增加。上述的BD組腦內FLI神經元數目增加的這些部位，均是與情感活動關系密切的部位，它們均發出纖維加入到前腦內側束，從而參加腦內犒賞系統(reward system）的構成﹝5，6﹞。在本結果中，BD組額皮質V層、中腦網狀結構和中縫背核內可見到胞核深染、胞漿淺染的FLI神經元胞體，提示這些神經元有變性性改變。其機制可能與應激所致神經元強烈而持續的興奮引起細胞內Ca2+過載有關。據文獻報道，在強制步行模型、慢性應激模型等其它抑鬱症動物模型中，也已找到犒賞系統內一些神經元結構受損的證據或線索﹝7，8﹞。犒賞系統受損會導致快樂體驗能力缺失，而後者是抑鬱症的核心症狀。
表1 BD組與對照組的40倍光鏡下FLI神經元數目比較（X±s,個）
| 組別 |
鼠數 |
前額 |
隔核 |
下丘腦 |
中腦 |
| 側皮質(a) |
外側核（a） |
室旁核（b） |
外側區（b） |
中央灰質（c） |
網狀結構（c） |
中縫背核（d） |
| BD |
10 |
49.4±3.7 |
41.6±3.2 |
20.8±4.4 |
12.4±1.6 |
46.3±5.2 |
6.5±1.2 |
4.8±0.4 |
| 對照 |
10 |
18.9±4.8 |
11.4±3.0 |
6.9±2.0 |
0 |
20.2±4.3 |
0 |
0 |
| F值 |
|
15.20 |
25.79 |
4.55 |
34.22 |
8.39 |
20.11 |
72.00 |
| P值 |
|
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.05 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.01 |
注：a.距耳間線9.29～9.48 mm、前囟0.20～0.48 mm層面； b.距耳間線7.70～7.60 mm、前囟-1.30～-1.40 mm 層面； c.距耳間線1.36～1.20 mm、 前囟-7.64～-7.80 mm層面； d.距耳間線-0.68～-0.80 mm、前囟-9.68～-9.80 mm層面 綜上所述，我們認為就神經功能通路水平而言，抑鬱症的發病可能與腦內犒賞系統強烈、持續的興奮引起此系統神經元內Ca2+過載而導致神經元變性有關。由于樣本數有限，進一步的探討有待今後繼續研究。
志謝 中國醫科大學腦研究所何為維教授
作者單位：鄭泰吉（133000吉林省延邊腦科醫院精神科)
崔尚允（延邊大學醫學院神經解剖研究室)
李光昭（延邊大學醫學院神經解剖研究室)
韓東日（延邊大學醫學院神經解剖研究室)
金昌洙（延邊大學醫學院神經解剖研究室)
孟凡強（北京醫科大學精神衛生研究所）
參考文獻
1，Porsolt rD, Anton A, Blavet N, et al. Behavioral despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol,1978, 47:379-391.
2，Senba E, Ueyama T. Stress-induced expression of immediate early genes in the brain and peripheral organs of the rat. Neuroscience Research, 1997,29:183-207.
3，Sagar SM, Sharp FR, Curran T. Expression of fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science，1988,240:1328-1331.
4，Bang SK, Kim WS. Increased fos expression by “behavioral despair” in rat brain. J Korean Neuropsychiatr Assoc, 1995,34:1949-1955.
5，西野仁雄.視床下部 | 
